响应面法优化酒大黄炮制工艺研究

曾昭君，田 甜，方朝缵，魏 梅，陈丹燕，钟如帆

(广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

大黄为药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎，性苦、味寒，归胃、脾、肝、大肠、心包经，具有泻下攻积、逐瘀通经、凉血解毒、清热泻火、利湿退黄等功效，是临床治疗便秘的常用药物[1]。大黄化学成分复杂，包含游离型和结合型蒽醌类衍生物、苯丁酮类、鞣质类、苯酚苷类、二苯乙烯苷类等成分[2-3]，其中结合型蒽醌是大黄泻下的主要成分[4]。大黄生品中蒽醌类成分既具有肝肾保护作用，也具有肝肾毒性，产生肝肾毒性的成分是结合型蒽醌[5-6]。大黄经过酒炙后，泻下作用的强度明显下降，结合蒽醌的含量降低，毒性降低[7]。

2015年版《中华人民共和国药典》中酒大黄饮片的炮制方法仅凭经验炮制，缺乏客观、量化的评价标准，无法保证炮制质量。本研究采用HPLC法测定芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚5种成分的含量，以结合蒽醌的含量为指标，采用响应面法，通过Box-Behnken响应面试验设计对酒大黄的黄酒用量、闷润时间、炒制时间3个因素进行考察，优选酒大黄肝肾毒性较小的炮制工艺参数，为今后酒大黄的炮制工艺研究提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Waters公司)；Eclipse XDB C18色谱柱(柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm)；ME204E万分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司)；HF-25型多功能炒果子机(万江富顺机械厂)；二两装高速中药粉碎机(111B型，浙江瑞安市永历制药机械有限公司)。

1.2 试药

本研究所用大黄(批号：YG1903039)购自希美(重庆)制药有限公司，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为蓼科植物药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎，经检验，均符合现行版中国药典“大黄”项下的规定，其中大黄总蒽醌的含量为2.00%，游离蒽醌的含量为0.71%，结合蒽醌的含量为1.29%。

芦荟大黄素对照品(批号：110795-201710)、大黄酸对照品(批号：110757-201607)、大黄素对照品(批号：110756-201512)、大黄酚对照品(批号：110796-201621)、大黄素甲醚对照品(批号：110758-201616，)均购自中国食品药品检定研究院；黄酒(绍兴柯桥第三酒厂)；甲醇(西陇科学股份有限公司)；水为超纯水(Milli-Q Direct超纯水)；三氯甲烷(广州化学试剂厂)；盐酸(广州化学试剂厂)；乙腈(默克股份有限公司)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法

2.1 考察因素选择

以黄酒用量、闷润时间、炒制时间为考察因素，每个因素3个水平，采用Design Expert 8.06软件 Box-Behnken Design设计试验方案。试验因素水平设计见表1。

表1 试验因素与水平

2.2 炮制方法

按表1设置考察因素水平，对大黄进行炮制：取大黄片100 g，加黄酒适量拌匀，闷润一定的时间，置炒药机器内，用文火炒制规定的时间，取出，晾凉。取已炮制好的酒大黄，除杂，用二两装高速粉碎机粉碎，过65目筛，备用。

2.3 总蒽醌和游离蒽醌含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为 Eclipse XDB C18(柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；柱温为30℃；检测波长为254 nm；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含40 μg的溶液；分别精密量取5种对照品溶液各2 mL，均匀混合，即得混合对照品溶液(每1 mL中各含8 μg的混合对照品溶液)。

2.3.3 供试品溶液的制备 ①总蒽醌供试品溶液的制备：精密称定各炮制品粉末0.15 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷至室温，再称定质量，用甲醇补足失去的质量，摇晃均匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置锥形瓶中，蒸去甲醇，加8%盐酸溶液10 mL，超声2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流60 min，放冷至室温，转置分液漏斗中，用三氯甲烷少量多次洗涤锥形瓶，并倒入分液漏斗中进行萃取，上层(酸液)再用三氯甲烷萃取3次，每次加入三氯甲烷10 mL，合并三氯甲烷溶液，于通风橱中回收溶剂，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇晃均匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。②游离蒽醌供试品溶液的制备：精密称定各炮制品粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流60 min，放冷至室温，再称定质量，用甲醇补足失去的质量，摇晃均匀，滤过，取续滤液，即得游离蒽醌供试品溶液。

2.4 结合蒽醌含量测定

总蒽醌含量与游离蒽醌含量的差值，即为结合蒽醌的含量。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别精密量取“2.3.2”项下混合对照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，得到6个浓度的混合对照品溶液。按“2.3.1”项下色谱条件测定，以各成分峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，分别绘制标准曲线，得出各成分的回归方程，结果见表2。结果表明，在线性范围内，各标准曲线与峰面积均呈现良好的线性关系。

表2 酒大黄各成分的线性关系

2.5.2 精密度试验 分别精密吸取“2.3.2”项下溶液10μL，连续进样6次，按“2.3.1”项下色谱条件测定色谱峰面积，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD值范围为0.15%～0.84%，相对峰面积的RSD值为0.16%～0.97%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 称取酒大黄样品粉末约0.5 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法平行制定供试品溶液6份，按“2.3.1”项下色谱条件进行各成分峰面积测定，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD值为0.21%～0.69%，相对峰面积的RSD值为0.94%～2.67%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、18、24 h注入高效液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD值为0.13%～0.92%，相对峰面积的RSD值为1.24%～2.35%，表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.6 含量测定方法

称取酒大黄样品粉末适量，精密称定，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分色谱峰面积，计算样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。色谱见图1。

注：1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚

3 Box Behnken响应面法优化炮制工艺

3.1 Box Behnken响应面试验设计

打开Design Expert(8.06)软件，选择Box Behnken Design 设计，输入黄酒量、闷润时间、炒制时间3个因素的最低和最高水平，设置5个中心试验点，以结合蒽醌的含量(%)为响应值，设计17个试验点的试验方案。方案与结果如表3所示。

表3 试验设计与结果 (%)

3.2 酒大黄炮制工艺响应面分析

将表3中各组数据运用Design Expert (8.06)软件进行分析，建立酒大黄炮制工艺中3个因素与结合蒽醌含量之间的二次回归模型方程，即：Y=5.841 2-0.096 7×A-4.429 6×B-0.341 7×C-0.046 6×A×B-0.005 2×A×C+0.000 7×B×C+0.007 4×A2+1.783 9×B2+0.020 6×C2，式中，Y代表酒大黄中结合蒽醌的含量，A、B、C分别代表黄酒用量、闷润时间、炒制时间。

运用Design Expert (8.06)软件对结合蒽醌的含量与3个因素的回归模型进行方差分析，结果见表4。

表4 方差分析

由表4可知，模型的P值为0.0160(P<0.05)，表明所建的回归模型具有显著统计学差异。失拟项P=0.1049(P>0.05)，模型失拟度不显著，表明所得方程与实际拟合中的异常误差所占比例较小，模型拟合情况良好，能较好地反映真实值；模型的相关系数R2为0.8797，表明该模型可以解释3个因素87.97%的变异性，反映酒大黄中结合蒽醌的含量与黄酒量、闷润时间和炒制时间关系密切，可以用来对酒大黄的炮制工艺参数进行分析和预测。

该模型中方差分析结果显著的分别是二次项B2和C2，表明闷润时间、炒制时间2个因素对结合蒽醌含量的影响极为显著；交互项AB、AC、BC对结合蒽醌含量的影响力强弱顺序为：AC>AB>BC。

由分析结果绘制三维响应面图和等高线图，研究黄酒用量、闷润时间、炒制时间3个考察因素对结合蒽醌含量的影响及其交互作用，结果如图2。因素AB、AC的交互作用稍强，因素BC交互作用稍弱，交互项对结合蒽醌含量的影响力强弱顺序为：AC>AB>BC，与表4方差分析结果一致。

3.3 最佳炮制工艺预测及试验验证

通过Design Expert 8.06软件对回归模型进行分析，可以预测酒大黄最佳炮制工艺为每100 g药材黄酒用量14.60 g，闷润时间为1.43 h，炒制时间为10.13 min，此时结合蒽醌的含量预测值为0.24%。结合生产实际需要，大黄酒炙后得最终炮制工艺参数为每100 g药材黄酒用量为15 g，闷润1.5 h，炒制10 min。

采用上述工艺进行3次验证试验，得到结合蒽醌的含量为0.23%，实际测定值与理论预测值低0.04%。结果表明，所建立的回归模型适用于酒大黄结合蒽醌含量的预测，与实际情况有较好的拟合性，其优化得到的炮制工艺参数准确、可靠、科学。见表5。

图2 各因素响应面图

表5 工艺验证 (%)

4 讨论

大黄味苦性寒，泻下作用峻烈，在临床应用中容易引起腹痛、恶心、呕吐等胃肠道反应。大黄泻下成分主要是结合蒽醌类成分，结合蒽醌类成分构架不稳定，经酒炙后，受黄酒用量、炮制温度、加热时间的影响，结构容易被破坏，结合蒽醌含量较生大黄少[8]，泻下作用的强度明显下降，减轻生大黄“苦寒败胃”的副作用，可避免导泻中引起腹痛、呕吐等不良反应[7-9]。

大黄中结合型蒽醌类成分对机体肝肾功能有不良影响，长期使用可能引起肝肾损伤，结合蒽醌含量的降低可减小肝肾毒性[10]。有研究表明，大黄经酒炙后，结合型蒽醌含量下降，泻下作用的强度明显下降，毒性降低[9]。

综上，本实验选择结合型蒽醌类成分作为响应值考察酒大黄炮制工艺，结合蒽醌含量的降低，表明酒大黄的炮制合格。本实验结果表明，大黄酒炙后，结合蒽醌含量下降明显(自1.29%下降至0.23%)，最佳炮制工艺为每100 g药材加入15 g黄酒，闷润1.5 h，炒制10 min，此结果可为工业化生产提供可靠的参考依据。