自由基对动物的危害及消除技术研究进展

■石宝明 迟子涵

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030）

自由基是指化合物分子由于共价键断裂，形成的具有不配对电子的原子或离子基团。自由基通常具有得到或失去电子的倾向，因此其化学性质十分活泼，易与机体的其他物质发生反应形成新的自由基或氧化物。动物体内自由基主要分为两类：一类是由氧转变而成的氧自由基，也称为活性氧，包括O2-、H2O2、OH-、RO·、ROO·和单线态氧O2等[1]；另一类为体内代谢过程产生的其他自由基，如硫自由基等。动物机体具有一套抗氧化清除系统，可以使自由基反应被阻断在各种代谢途径之中，以此维持机体内自由基生成与清除的动态平衡。当机体处于正常状态时，自由基可以在动物体内作为信息分子和调控分子，是一种具有广泛作用的多功能介质。当机体自由基稳态被打破时，自由基积累过多，此时自由基作为一种具有细胞毒性的氧化剂，会对机体内的蛋白质、核酸和脂质等造成损伤，从而引发细胞的结构被破坏，甚至引发细胞的突变。饲料作为动物摄入营养成分的最主要的营养物质，在对动物体内自由基平衡的调控方面起着重要作用。

1 自由基的产生

生物体内自由基来源分为外源与内源[2]。外源自由基的产生通常是由于外界环境改变引起的，摄入某些药物（如抗生素等）也有可能导致外源性自由基产生。动物体内的自由基大多为内源自由基，由动物体正常代谢反应产生，包括酶促反应与非酶促反应。

1.1 酶促反应产生自由基

酶促反应产生的自由基主要集中在线粒体。与线粒体呼吸链有关的酶与这部分自由基的生成有重要关系。高达3%的氧气可以从能量产生过程中逃逸出来，成为自由基，从而破坏所有类型的生物分子，包括脂质、蛋白质和DNA[3]。线粒体的内外膜间隙及间液中含有许多参与呼吸链酶和辅酶，电子传递时可产生氧自由基。另外，NADPH氧化酶、细胞色素P-450还原酶、醛氧化酶、谷胱甘肽还原酶、二氢乳酸脱氢酶等都可以催化一些反应产生O2-[4-6]。黄嘌呤氧化酶、D-氨基酸氧化酶等可以催化一些反应产生H2O2[7]。

1.2 非酶促反应产生自由基

该部分自由基的产生方式通常是由自由基作为引发基而发生的连锁反应。此类反应通常由自由基参与，通过电子转移或共价键断裂，在体内其他物质的参与下产生更多种类的自由基。例如：在机体内的铁、铜、铬、钒等金属离子的催化下H2O2和O2-能迅速反应生成OH-[8]。一些物质如血红蛋白、肌红蛋白、甘油醛、维生素C等也可发生自氧化产生O2-。

2 自由基对生物体的危害

当动物处于疾病或衰老状态时，机体不能有效清除体内自由基，自由基积累过多导致组织损伤从而引发疾病。

2.1 自由基对脂质的损伤

自由基性质活泼，与细胞膜不饱和脂肪酸相遇后，能够夺取不饱和脂肪酸亚甲基中的氢原子，从而引发脂质过氧化。自由基引发的脂质过氧化是一种链式反应，包括三个阶段：链引发、链增长和链终止[9]。随着脂质中不饱和脂肪酸的减少，细胞膜蛋白比例失衡，细胞膜通透性增强。Ca2+转运不断增强，ATP酶等许多钙依赖性蛋白酶被激活。自由基过多时，会使链式反应不断进行从而导致细胞膜进一步受损，细胞完整性被破坏甚至引发细胞死亡。线粒体由于呼吸作用不断产生自由基，当自由基清除系统受损时，线粒体膜受到破坏，抑制线粒体功能表达，ATP产生减少从而影响细胞能量代谢。已有研究表明，脂质过氧化与包括奶牛在内的家畜的多种疾病状态以及生产性能和繁殖性能下降密切相关[10-11]。

2.2 自由基对核酸的损伤

自由基对DNA的攻击包括修饰DNA碱基以及引发DNA链的断裂。DNA碱基性质活泼，易被自由基氧化损伤，是自由基攻击的主要靶点[12]。鸟嘌呤的还原电位最低，因此鸟嘌呤是羟基自由基主要进攻位点[13]。羟基自由基对嘌呤分子的攻击位点主要集中在C4、C5、C8以及C2位置[14]。DNA链断裂是DNA损伤的另一种具象化表现[15-16]。活性氧(ROS)能够抽离DNA环上的H原子致使DNA链断裂。OH-会夺去DNA脱氧核糖环不同位点的H并形成碳基自由基。夺取的难易程度为：H5＞H4＞H3≈H2＞H1[17-18]。自由基与碱基反应形成的加合物也可发生单分子开环反应，进而发生分子间或分子内的抽氢反应，最终引起核酸链的断裂。此外，H原子还能与DNA分子碱基的双键进行加成反应，形成H-加合物，从而引发DNA链断裂。

2.3 自由基对蛋白质的损伤

活性氧与脂质和糖化蛋白反应产生的醛和酮可以修饰蛋白质。自由基介导的氨基酸损伤主要会造成肽链裂解、氨基酸侧链的氧化，同时引发蛋白质的交联。氧化应激引起的蛋白质活性和功能改变会导致蛋白质中半胱氨酸和蛋氨酸的直接氧化。当运输蛋白受到自由基攻击时，会导致血液中的营养物质不能被正常输送到生物体内。一些化合物还可以在过氧化氢的条件下与血红蛋白发生氧化反应，产生溶血现象。此外，通过凝胶色谱进行研究发现，活性氧对氨基多糖和蛋白多糖也有损伤作用[19]。

3 自由基产生与饲料中营养物质的关系

对于动物来说，饲料内的各种营养物质对于体内自由基的清除与产生起重要作用。当营养物质比例失调时，体内自由基无法被及时清除，从而导致机体受损。

3.1 蛋白质对自由基的影响

蛋白质是参与机体抗氧化系统组成的重要物质，抗氧化防御系统包括机体内抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷氧还蛋白(Grx)等和非酶谷胱甘肽系统，二者均有氨基酸参与构成。SOD是最重要的抗氧化剂之一[20]。GSH-Px是一种丰富的细胞内硫醇，在氧化剂的解毒过程中起着至关重要的作用，其在许多不同的细胞中都是一种重要的抗氧化剂[21]。一些小肽更是可以直接清除体内自由基。饲料中蛋白质的缺乏不仅会影响体内抗氧化酶的合成，还可能降低动物体内抗氧化剂的合成。饲料中蛋白质浓度过高也可能会导致动物体内自由基含量升高。Wu等[22]发现增加饲料蛋白的摄入能够诱导大鼠NOS产生，从而增加大鼠体内NO的含量。

3.2 脂质对自由基的影响

饲料中通常含有多不饱和脂肪酸，被动物摄入后可经氧合反应产生氧化脂质。氧化脂质自身可作为氧化剂，同时也可以促进氧化剂的生成。有研究表明，环氧合酶(COX-2)可催化不饱和脂肪酸产生前列腺素以及血栓素等氧化脂质。这些氧化脂质会刺激COX-2途径活化，同时导致ROS生成增加[23-24]。Li等[25]发现，花生四烯酸的代谢产物15-羟化二十烷四烯酸(15-HETE)能够诱导ROS的生成。Han等[26]发现，20-羟化二十烷四烯酸(20-HETE)能够提高线粒体内ROS的生成。然而，一些氧化脂质不会促进体内自由基产生，反而可以起到清除体内自由基的效果。氧化脂质(PGD2)可经脱水反应生成15-dPGJ2，该物质可抑制NF-κB信号通路从而降低COX-2的表达，减少促炎氧化脂质的产生，从而保护细胞免受氧化损伤[27-28]。同时，15-dPGJ2还可以增加一些抗氧化酶(SOD、GSH-Px等)的基因表达[29-30]，从而起到清除体内自由基的作用。Chen等[31]发现，人脂氧素A4(LXA4)可以提高细胞内SOD活性，提高细胞内谷胱甘肽(GSH)水平从而保护肝脏免受氧化损伤。在饲料中添加过量脂肪可能是引起动物体内自由基积累过多的原因之一。有试验表明，高脂饲料诱导了NADPH氧化酶亚基gp91，并促进了结肠上皮细胞和固有层细胞中活性氧的产生[32]。Zalewska等[33]发现饲喂高脂饲料的大鼠腮GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值显著降低，GSSG水平显著升高。大鼠腮腺中自由基产生以及脂质过氧化明显。Li等[34]发现，高脂饲料可以加重肠道氮氧化物(NOx)相关的氧化应激，导致肠紧密连接的完整性丧失，从而增加肠道通透性。

3.3 维生素对自由基的影响

在动物体内，许多维生素可以起到抑制自由基产生以及清除体内多余自由基的作用。如VA、烟酸以及一些类胡萝卜素均可通过抑制细胞内iNOS基因的表达从而降低体内NO的产生，因此维生素可以抑制NO自由基诱发的细胞毒性。VE还可以抑制ROS诱发的脂类H2O2自由基的生成。除了影响自由基的产生，维生素还可以参与自由基的清除。VC与VE在体内充当抗氧化剂时会产生协同作用。VC可以从自由基中再生VE从而增强VE的抗氧化效果。VC能够清除动物体内的次氯酸和酪氨酸自由基，保护脂质免受活性氧诱导的氧化反应。Fischer-Nielsen等[35]发现VC能够减弱自由基诱导的氧化损伤。类胡萝卜素可以抑制自由基的活性从而起到抗氧化的作用，一些类胡萝卜素可以与ROO·反应生成无活性的产物从而使其丧失功能。β-胡萝卜素还可以破坏脂质过氧化的链式反应，从而保护细胞膜免受氧化损伤。

3.4 矿物质对自由基的影响

饲料中矿物质元素的含量也会影响动物体内自由基的水平。在矿物质元素中，硒被认为是最重要的抗氧化剂。目前在动物组织中发现了25种硒蛋白，其中一半以上直接或间接参与维持身体氧化还原平衡和抗氧化防御。硒在动物体内以硒代胱氨酸(SeCys)的形式存在，是各种硒蛋白的重要组成部分，而硒蛋白是动物体内抗氧化网络的重要元件以及调节剂。硒是GSHPx的辅助因子,是该酶的活化中心。当饲料中硒含量不足时，会导致GSH-Px活性降低，从而影响体内H2O2与ROOH自由基的降解。研究发现，饲喂蛋鸡含硒饲料可以使其血浆中GSH-Px和SOD活性显著升高[36]。此外，有研究表明补硒鸽子的睾丸和卵巢中GSH-Px4表达增加[37]。锌在延缓氧化过程中起着重要的生化作用，因此也是一种潜在的抗氧化剂。锌代谢异常会使氧自由基产生增加并导致严重的氧化应激[38]。锌还可以促进金属硫蛋白的合成，金属硫蛋白中含锌的巯基化合物簇可以有效清除羟基自由基。铜在动物体内对自由基清除具有双重生物学效应，动物摄入高铜或低铜均会造成脂质过氧化水平提高。

4 饲料调控动物体内自由基的方法

4.1 添加维生素

饲料中通常加入VA、VE、VC等作为抗氧化剂。VE不仅可以抑制自由基的产生，还可以抑制细胞膜内多不饱和脂肪酸的氧化，预防脂质过氧化物的产生。VC的抗氧化活性主要是通过清除自由基实现的，VC作为电子供体可清除OH·、ROO·等自由基。Yokota等[39]发现饲喂缺乏α-生育酚饲料的小鼠大脑脂质过氧化作用增强，同时神经衰退现象增强。Surai等[40]发现在种鸡或公鸡的饮食中补充VE，提高了它们对氧化应激的抵抗力。在饲料中添加维生素除了可以起到清除多余自由基的作用，还可以改善肉质，提高动物生产性能。Belles等[41]研究表明，在饲料中加入VE可以保持羊肉肉色同时改善脂质过氧化水平。

4.2 添加酚类物质

酚类物质因其含有苯环的特殊结构，可作为良好的电子与氢的供体。其本身不易与氧结合，性质相对稳定，因此是一种良好的抗氧化剂。Wang等[42]发现，白藜芦醇可以提高血浆中SOD等抗氧化酶的活性，同时增加GSH含量，起到抗氧化的作用。陈丹丹[43]发现，茶多酚能够减弱脂质过氧化，具有良好的抗氧化能力。

4.3 添加抗氧化肽

抗氧化肽在体外可以直接清除自由基。研究发现，抗氧化剂化合物中H-X基团的键电离能(BDE)决定了反应活性，键电离能越大，反应活性越强[44-45]。因此，含有诸如酪氨酸、色氨酸和组氨酸等能容易给质子的氨基酸基团的抗氧化肽，通常通过H原子转移的机制淬灭自由基。一项关于玉米蛋白的研究发现，HAL⁃GA和HAIGA肽在氧化自由基吸收能力(ORAC)试验中具有不同的活性，前者的活性大约是后者的1.6倍[46]。在细胞内，抗氧化肽主要通过调节抗氧化酶减少脂质过氧化[47]，以及提高GSH含量，降低GSSG含量，维持GSH/GSSG比值的稳定保护细胞氧化损伤。机体可以通过核转录因子Nrf2调节氧化应激。加入抗氧化肽后会增强Nrf2基因的表达从而增加抗氧化酶的合成。Kim等[48]发现藻胆蛋白抗氧化肽可通过Nrf2-SOD通路降低H2O2介导的氧化损伤，并恢复SOD的表达。抗氧化肽还可以通过调节细胞内的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）水平从而保护细胞免受氧化损伤。γ-GCS是一种重要的调节和限速酶，可以平衡胞内GSH水平[49]。γ-GCS在细胞中的表达水平可以影响体内GSH的含量。当体内活性氧含量过高时，细胞处于氧化应激状态，γ-GCS含量也会下降[50-51]，导致GSH合成减少，同时活性氧引起了GSH消耗增加，最终导致细胞内GSH含量减少，GSH/GSSG稳态失衡。张燕[52]以不同浓度的蛋清源抗氧化肽处理HEK293细胞发现γ-GCS基因相对表达量较损伤组有一定程度的提高，细胞的抗氧化能力得到提高。

4.4 添加虾青素

虾青素是在水生动物中发现的一种酮式类胡萝卜素。与其他类胡萝卜素相比，虾青素酯化能力更强、抗氧化活性更高，同时构型更加极化。虾青素可以将激发O2的能量吸收到类胡萝卜素链上，促使类胡萝卜素分子降解，并防止其他分子或组织受到损害[53]。还可以防止由多不饱和脂肪酸降解引发的连锁反应产生自由基，从而保护膜磷脂和其他脂质免受过氧化的损伤[54-55]。虾青素的抗氧化活性已在多项研究中得到证实。在某些情况下，虾青素清除自由基的能力数倍强于维生素E和β-胡萝卜素。Hormozi等[56]发现，虾青素可以提高LS-180细胞中SOD、CAT以及GSH-Px活性，显著降低丙二醛水平，从而使细胞抗氧化活性显著提高。Dose等[57]使用光子计数法测定了虾青素的氧猝灭活性，发现合成虾青素具有良好的自由基清除以及抗氧化能力。虾青素不能由动物合成，必须从饮食中获得，因此在饲料中添加虾青素可以作为一种有效的清除自由基的手段。

4.5 添加植物提取物

植物提取物是从植物中提取出的一种活性物质，其在生物体内能发挥包括氧化作用的多种功能，可以作为天然抗氧化剂加入到饲料中。植物提取物可以减少机体自由基的产生，其抑制自由基产生的方式依赖于其抑制氧化酶活性的能力。潘峰等[58]发现，绞股蓝皂苷可以降低细胞内黄嘌呤氧化酶(XOD)和髓过氧化物酶(MPO)的活性，从而减少大鼠的自由基产生。一些植物提取物可以作为电子供给体从而起到直接清除自由基的作用。这些植物提取物中含有还原性基团，可以减缓自由基链式反应。植物提取物还可以调节动物体内抗氧化酶系统从而改善动物清除自由基的能力。研究表明,在砷诱导氧化损伤中，姜黄素可以提高Nrf2表达量,调节体内抗氧化酶的表达从而减弱氧化损伤[59]。Machha等[60]研究表明，口服槲皮素可以提高糖尿病大鼠模型SOD活性以及总抗氧化能力。Rubiolo等[61]发现，白藜芦醇可以激活Nrf2通路，增加抗氧化酶基因表达量，提高抗氧化酶活性并增强机体抗氧化能力。

4.6 添加多糖

一些多糖具有较为良好的抗氧化能力，其本身具有对自由基的清除能力，可以吸附自由基避免自由基对细胞造成损伤。同时多糖可以提升机体自身抗氧化系统的防御能力，使机体自身自由基清除能力提高。Anandan等[62]发现，壳聚糖可以提升老龄小鼠模型心脏组织GSH、GSH-Px以及谷胱甘肽还氧酶（GR）水平并能达到幼年小鼠水平，从而减弱自由基损伤。Wang等[63]发现，滩枣源多糖可以清除自由基，减弱CCl4诱导的肝损伤。一些植物源多糖均在体外检测出良好的自由基能力。青竹梅多糖可以有效清除·OH，蓝莓多糖能够清除·OH和DPPH，生姜多糖清除DPPH·能力较强[64]，南瓜多糖能够清除O2-[65]。

5 小结

综上所述，自由基通常在动物体内保持平衡，当这种平衡遭到破坏时，会对动物体造成多种损伤。饲料是动物获取营养物质最主要的手段，因此调节饲料中各种营养物质的配比对于调节动物体内自由基平衡是至关重要的。了解各种营养物质对体内自由基产生以及清除的影响，并研发出健康的新型饲料，从而在供给动物均衡营养的同时，提高动物的抗氧化能力。这将对畜牧业产生重要的良性影响。