环状RNA在肺腺癌中的作用及机制研究进展

黄小碧，周宏莲，杨志雄，喻慧，苏文媚

1广东医科大学第一临床医学院，广东湛江524001；2广东医科大学附属医院肿瘤中心

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，根据组织病理学，肺癌分为非小细胞肺癌（NSCLC，85%）和小细胞肺癌（15%），其中肺腺癌是NSCLC的主要组织类型［1］。尽管在手术切除、化学疗法和放射疗法方面已取得一定进展，但肺腺癌的5年生存率仍较低［2］。其主要原因可能是免疫系统的抑制、细胞的增殖、肿瘤的远处转移以及药物的抵抗［3］。因此，迫切需要找到肺腺癌的新型早期诊断生物标志物和治疗靶标。近年来，多项研究发现肺腺癌中的一类靶目标是非编码RNA。环状RNA（circRNA）是一种特殊的非编码RNA，具有环状共价闭合结构，对RNA核酸核酶的耐受性更高，表现出高度的稳定性，且它的异常表达与多种癌症相关，如结肠癌［4］、肝细胞癌［5］、卵巢癌［6］等，发挥致癌或抑癌作用。已有研究证实，circRNA在肺腺癌组织和癌旁组织以及肺腺癌不同TMN分期中存在差异性表达，在肺腺癌的增殖、转移和预后等方面起一定作用，可作为肺腺癌预测或预后的生物标志物，为早期治疗提供了新靶点和新思路。现就circRNA在肺腺癌中的作用及作用机制进行综述。

1 circRNA在肺腺癌中的作用

1.1 临床作用 目前，肺腺癌的诊断主要有赖于影像学诊断和病理诊断，但病理活检有一定的创伤性，而影像学诊断在早期的诊断存在一定的局限性。有多项研究已经证实了circRNA在消化系统、心血管系统、神经系统等疾病中能作为早期诊断或预后的生物标志物。circRNA是否能成为生物标志物应用于肺腺癌的早期诊断和治疗靶点，目前成为国内外研究的热点。ZHAO等［7］采用高通量circRNA微阵列技术检测4对早期肺腺癌组织和正常组织，发现肿瘤样品中共有357个circRNA失调，有5个circRNA（hsa_circ_0404833、0406483、0006411、0401977、0001640）差异表达显著，提示circRNA在早期肺腺癌中具有潜在的预测作用，也为肺腺癌的遗传学研究提供了新的思路。ZHU等［8］发现近60个circRNA分子在肺腺癌组织中的表达有改变，并证明hsa_circ_0013958在肺腺癌中过表达，其表达水平与TNM分期和淋巴转移相关，肺腺癌诊断的受试者工作特征（ROC）曲线下面积为0.815，提示hsa_circ_0013958有望成为肺腺癌潜在生物标志物和治疗靶点。

此 外 ，circABCC4［9］、circPRKCI［10］、circRNAENO1［11］、circ-SOX4［12］均在肺腺癌中过表达，都参与肿瘤的发生和发展过程，为肺腺癌的早期诊断和早期治疗提供了新视角。circRNA不仅在肺腺癌的早期诊断中有帮助，而且在NSCLC的亚分型诊断上亦具 有 重 要 的 潜 力。WANG 等［13］报 道 hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495在肺腺癌和肺鳞癌中差异表达，可以分别作为两者的诊断/亚型标记物。在肺腺癌的生存预后方面，circRNA亦具有潜在意义。如circ_0001946的表达与肺腺癌的TNM分期、肿瘤直径呈正相关，与患者的总体存活率呈负相关，有望成为预后评估的靶点［14］。可见，circRNA在肺腺癌的早期诊断、早期治疗及预后评估中具有潜在的临床意义。

1.2 生物学作用 已有较多证据显示，circRNA在肺腺癌的增殖、凋亡、侵袭、转移［4］和分化等生物学过程中起作用。肺腺癌中的circRNA主要扮演两大角色，一是充当癌基因发挥致癌作用，二是发挥抑癌作用。

1.2.1 致癌作用 目前的研究显示，与癌症相关的circRNA在功能上被证实较多的是其致癌作用，证明circRNA驱动癌症进展。实时荧光定量PCR技术检 测 显 示 ，hsa_circ_0013958［8］、circ ABCC4［9］、circRNA-ENO1［11］、hsa_circ_0025036［15］等 在 肺 腺 癌 组织及细胞系中过表达，均能促进肺腺癌细胞的增殖、迁 移 ，并 抑 制 其 凋 亡 。 hsa-circ-0000211［16］、circ TSPAN4［17］、circ-CAMK2A［18］在肺腺癌中表达上调，促进肿瘤细胞侵袭和转移，从而调控肺腺癌的进展。此外，has-circRNA-002178［19］能增加肺腺癌细胞的肿瘤免疫逃逸能力，促进肿瘤的生长和转移。可见，circRNA在肺腺癌中充当癌基因影响肿瘤的进展。

1.2.2 抑癌作用 大部分circRNA在肺腺癌中过表达并发挥致癌作用，少部分通过下调表达而发挥抑癌作用。较早在肺癌细胞中发现的circRNAITCH［20］可作为肿瘤抑制因子，通过增强其亲本基因ITCH的表达而抑制肺癌细胞的增殖。YU等［21］采用实时荧光定量PCR检测发现，与癌旁组织相比，circRNA cMras在肺腺癌组织中呈低表达，且在体外细胞系（A549、H1975和H1299）中表达也被下调，并证实了circRNA cMras抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，证明其潜在的抑癌功能。体外细胞实验中发现，circCRIM1在H1299、pc9和H2228细胞系表达下调最明显，且Transwell和Matrigel分析显示circ-CRIM1抑制肺腺癌细胞的侵袭和转移［22］。最近的研究也证明，circ_0006427可以逆转肺腺癌上皮间充质转化，抑制细胞的增殖、迁移和侵袭，并且在动物实验中进一步证明了circ_0006427的过度表达可抑制肿瘤的生长［23］。诸多研究显示，circRNA可以抑制肺腺癌细胞的生长、转移和上皮间充质转化，发挥抑癌作用。

2 circRNA在肺腺癌中的作用机制

2.1 microRNA（miRNA）海绵吸附作用 miRNA是基因表达的重要转录后调节因子，它通过直接碱基配对作用于mRNA的非翻译区内的靶位点，从而抑制转录后基因表达。而circRNA作为一种特殊的具有竞争性的内源性RNA，富含miRNA结合位点，它主要通过与miRNA结合，从而阻碍miRNA与mRNA的结合，最终抑制miRNA的功能或降低miRNA的活性。如ciRS-7被证明具有76个miR-7结合位点［24］，可抑制miR-7的活性而影响阿格蛋白（AGO）的表达。目前在肺腺癌的众多研究中，荧光素酶测定显示circRNA的作用机制主要是充当miRNA海绵，该机制不仅参与circRNA对肺腺癌的致癌、抑癌过程，而且贯穿于circRNA诱导肺腺癌细胞发生药物抵抗的始终。其中hsa_circ_0012673通过抑制靶向erb-b2受体酪氨酸激酶3（ErbB3）的miR-22而促进肺腺癌细胞的增殖［25］。circABCC4通过miR-3186-3p/TNRC6B轴促进肺腺癌的增殖、迁移，并抑制细胞凋亡［9］。circ_0001946通过使miR-135a-5p海绵化从而上调SIRT1并激活Wnt/β-catenin信号通路来促进肺腺癌进展［14］。另外，circRNA cMras和circCRIM1分别充当miR-567、miR-182的海绵来抑制肺腺癌的生长和转移。hsa_circ_0003998通过抑制miR-326的表达而增加肺腺癌的耐药性，可作为潜在的化学抗性启动子［26］。以上研究均表明circRNA通过海绵吸附miRNA而发挥作用。

2.2 调节蛋白表达 circRNA可以直接或间接与相应蛋白结合形成RNA-蛋白复合物，进而发挥调节作用。CHEN等［27］报道，circRNA与蛋白的关系类似于与miRNA的“海绵”特性，可以利用特定区域与某些蛋白质相互作用，充当蛋白质“海绵”。如circRNA与AGO、盲肌蛋白（MBL）等结合进而调节RNA结合蛋白［24-28］，最终参与细胞增殖、分化、凋亡等过程。虽然此方面有关肺腺癌研究甚少，但已有研究显示circ-MTO1过表达可以提高RNA结合蛋白QKI-5的表达，而QKI-5表达增加反过来又促进了circ-MTO1表达，两者过表达协同下调miR-17的表达，从而抑制肺腺癌的生长，为肺腺癌的分子机制研究提供了新见解［29］。另外 hsa_circ_0013958通过miR-134的海绵间接上调细胞周期蛋白D1，从而促进肺腺癌的发生发展［8］。

2.3 调控基因转录 事实证明，在细胞核中的circRNA能与RNA聚合酶形成转录复合体来参与基因的表达调控，如来源于内含子的ciRNA可以逃离脱支酶的分解作用，并与RNA结合酶Ⅱ相互作用，从而正向调节基因转录［30］。如circRNA circ-DONSON依赖转录因子SOX4的NURF复合物促进胃癌的生长和侵袭［31］。而QIU等［10］在研究circPRKCI促进肺腺癌生长时发现，转录因子E2F7是circPRKCI的下游目标，circPRKCI的过表达会增加E2F7转录因子的蛋白质水平，反之亦然。先前众多研究表明，烯醇化酶1（ENO1）［32］作为一种糖酵解酶，可通过调节肿瘤糖酵解而影响肿瘤进展。而ZHOU等［11］在肺腺癌的研究中发现，ENO1是circ-ENO1的宿主基因，circ-ENO1调控ENO1的转录，沉默circ-ENO1可以降低ENO1的表达并导致烯醇酶活性和乳酸生成降低，表明circ-ENO1调节ENO1的表达以调节肺腺癌细胞中的糖酵解，从而促进肺腺癌的进展。

2.4 调节细胞自噬 自噬是一种自我降解和再循环的过程，它在保持细胞体内的平衡发挥重要作用，并与多种形式的人类疾病（包括癌症）有关［33］。研究发现 circHIPK2［34］、circHECTD1［35］能诱导星形胶质细胞的自噬而使其活化，从而影响缺血性脑卒中。hsa_circ_0023404［36］抑制自噬介导的细胞凋亡而增强宫颈癌细胞对顺铂的化学耐药性。但自噬是促进还是抑制肿瘤形成一直是争论的话题。DU等［37］发现circ-DNMT1通过促进p53的核转位诱导细胞自噬来增强乳腺癌进展。但有研究发现，在突变型STK11肺腺癌细胞系（A549和 H838）中，沉默circHIPK3［38］能诱导肺腺癌细胞系的自噬而抑制癌细胞的生长。目前，circRNA与自噬的关系在肺腺癌中的研究相对较少，有待进一步挖掘和探讨。

2.5 利用外泌体的功能 外泌体是一种直径30～100 nm的小囊泡，具有脂质双层膜结构，在血浆、血清、唾液和尿液等广泛存在［39］。这些囊泡包含蛋白质、脂质、miRNA、长链非编码RNA（lncRNA）和circRNA，它们在维持生理状态和疾病进展中具有重要功能［39-40］。据报道，外泌体在细胞内携带和传递致癌分子，作为致癌物的信使在肿瘤的进展中起着至关重要的作用［39］。已有研究证实，在外泌体中有大量circRNA存在，其可以促进胰腺癌［40］、胃癌［41］、大肠癌［42］的发生发展。CHEN等用高通量测序法全面分析了5对肺腺癌患者和健康人的血浆外泌体circRNA表达谱，鉴定出182个差异表达的外泌体circRNA，其中 hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0001346表达上调，可能是肺腺癌的新型潜在早期诊断标志物。最近WANG等［19］也发现circRNA-002178高表达于肺腺癌患者血浆的外泌体中，它利用外泌体的功能通过miR-28-5p传递信号到CD8+T细胞中以促进程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的表达，避免了免疫系统的识别和攻击，从而促进肺腺癌的生长和转移，且可作为肺腺癌早期诊断的生物标志物。

2.6 与lncRNA相互作用 越来越多的研究证明，circRNA和lncRNA与人类疾病密切相关，尤其是对癌症（包括肺癌）的促进或抑制作用。虽然两者在生物学功能和应用上有一定的区别，但是两者具有较多的共同点，circRNA和lncRNA都含有可翻译为功能性小肽的短开放阅读框，都能编码蛋白，都可以通过海绵miRNA促进癌症或抑制癌症的发生［43-44］。那么两者在肿瘤的发生中是否产生协同或拮抗作用，这值得关注和思考。有学者提出circRNA和线性RNA的形成共享一些常见的外显子，它们可能彼此竞争［45］。CHEN 等［38］在肺腺癌中研究证实 circHIPK3和线性HIPK3（linHIPK3）在自噬调节方面产生拮抗作用，还证明了circHIPK3和linHIPK3两者之间的比例（C∶L）能够反映癌细胞的自噬水平，并提出较高的C∶L值（＞0.49）预示患者预后不良，说明circRNA和lncRNA在癌症的分子机制中有一定的竞争关系。再如circRNA-ITCH在肺癌［20］和卵巢癌［46］中均表达下调，但最近的研究发现，在卵巢癌中circRNA-ITCH与lncRNA呈负相关，两者产生拮抗作用，最后证实circRNA-ITCH通过下调lncRNA HULC表达而抑制卵巢癌的增殖。在肺腺癌中circRNA-ITCH与lnRNA是否也是对立关系，有待进一步研究。

3 circRNA与肺腺癌耐药性的相关性

尽管靶向治疗和免疫治疗为肺腺癌的治疗带来很大的希望，也得到不断改善和发展，但是肿瘤的耐药性仍然存在。越来越多的研究证明，部分circRNA能够抵抗化疗药物而影响患者的预后。如circFGFR1不仅促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，且通过海绵miR-381-3p上调CXCR4表达而发挥其免疫抑制作用，使NSCLC细胞中的CD8+T细胞减少，从而增强了NSCLC细胞对PD-1抗体免疫治疗的抗药性［3］。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼、依科替尼和埃洛替尼等，为NSCLC治疗的关键，有必要对其耐药机制进行深入研究。JOSEPH等［47］发现 cirRNA CCDC6在肺腺癌及 EGFR 耐药H1975细胞系中均高表达，其在肝细胞生长因子及其受体的调节下可增加肺腺癌细胞对吉非替尼、埃洛替尼的耐药性，为化疗药物治疗提供了靶标。MAO 等［48］在 104例肺腺癌患者中发现，circRNA CDR1-AS的表达与患者新辅助化疗（培美曲塞和顺铂）呈正相关，与生存时间呈负相关，还证实了CDR1-AS在对培美曲塞（PTX）和顺铂（CDDP）耐药的肺腺癌组织和细胞系（A549/CR）中过表达，药物敏感性检测发现CDR1-AS能诱导肺腺癌细胞对PTX和CDDP的抵抗。另外，在肺腺癌组织和对多西他赛耐药细胞系（A549/DTX和H1299/DTX）中hsa_circ_0003998［26］表 达 也 上 调 ，敲 低 hsa_circ_0003998可以降低肺腺癌细胞对多西他赛的化学耐药性。由此可见，circRNA在调节多种化疗药物敏感性方面发挥重大作用，有望成为化疗药物耐药研究的突破点。

4 问题和展望

越来越多的证据显示，circRNA的异常表达可促进或抑制肺腺癌的发生发展，并在调节药物耐药性方面发挥重要作用，可作为肺腺癌早期诊断和治疗的潜在生物标志物。但是目前对circRNA的研究仍处于初始阶段。第一，自然界中已发现数以千计的circRNA，但在肺腺癌中仅对少部分circRNA进行了研究，且样本量有待扩大，还有更多的circRNA及其相关机制需要去挖掘；第二，circRNA在肺腺癌中的作用机制尚未研究成熟，目前多数学者主要研究circRNA的miRNA海绵吸附作用，而circRNA对蛋白的编码功能研究甚少，且circRNA与自噬、外泌体和lnRNA的关系亦有待进一步研究；第三，已证实circRNA可以被分泌到细胞外环境中，方便提取，这为临床诊断和治疗提供了新策略。但目前所发现的circRNA，仍处于基础研究中，还未完全投入临床实践，尤其是在肺癌的靶向治疗方面有待进一步深入。

尽管目前对circRNA生物学作用及机制的研究还有限，但随着生物技术的发展，以及人类对circRNA研究的不断探索，可能会发现更多与肺腺癌相关的circRNA，对其生物学发病机制将会更加明确，为肺腺癌的诊断和治疗提供更新的视角和更好的策略。