长链非编码RNA NORAD对氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞功能障碍的影响及机制

赵晓雪，张冰玉，刘宇翔

辽宁省金秋医院综合老年医学科三病房，沈阳110016

动脉粥样硬化（AS）是全球发病和死亡的首要原因，但目前为止其发病机制仍未完全明确。已知的公认发病机制包括代谢紊乱、内皮细胞功能障碍、免疫反应异常以及慢性动脉壁炎症等。内皮细胞功能障碍是AS病变的首要步骤，可以通过对一氧化氮的生物利用度、缩血管物质生成、血小板聚集、趋化因子生成、单核细胞贴壁等方面的影响，最终导致AS的发生及进展［1］。AS的发病机制复杂，涉及因素较多，因此探索新的机制仍具有迫切性和现实意义。长链非编码RNA（lncRNA）能够通过修饰和调控编码基因的转录，直接与蛋白质或编码蛋白本身结合，从而影响多种生物学过程。现有研究显示lncRNA在心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚、心律失常等心血管疾病的发生发展中均发挥了关键的作用，显著影响患者的预后和生存［2］。越来越多的证据表明，lncRNA将成为一种有前景的药物治疗靶点。lncRNA NORAD可以维持细胞基因组的稳定，与肾癌、淋巴瘤等的不良预后有关，但在AS发病过程中的作用仍不明确。本课题组在2020年6月—11月，对NORAD与AS之间的关系进行了初步研究，通过观察NORAD对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的内皮细胞功能障碍的调控作用，探讨其对AS的影响及潜在分子机制，为疾病的诊断和治疗提供新的生物标志物和靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自上海中乔新舟生物科技有限公司，ox-LDL购自北京协生生物科技有限责任公司，Opti-MEM购自美国GIBCO公司，Powder琼脂糖购自法国Biowest公司，FastDigest BamHI、FastDigest HindⅢ购自上海Thermo Scientific公司，Lipofectamine2000购自美国invitrogen公司，质粒大量制备试剂盒、TRIpure、Super M-MLV 反 转 录 酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix购自北京BioTeke生物技术有限公司，SYBR Green购自德国Sigma公司，Western及IP细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和其他Western blotting试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司，核因子κB p65（NF-κB p65）与磷酸化核因子κB抑制蛋白（p-IκBα）购自Abclonal公司，山羊抗兔IgG购自beyotime公司，Histone H3购自proteintech公司，β-actin购自BOSTER公司，白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及细胞间黏附分子1（ICAM-1）的ELISA检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。

1.2 HUVECs的培养与ox-LDL处理 将HUVECs接种于6孔板中，分为阴性对照组、实验组1、实验组2、实验组3，用含20%胎牛血清的M199完全培养基于37℃、5%CO2的培养箱内培养，待细胞贴壁换用无血清的基础培养基处理HUVECs 1 h，各组分别加入0、50、100、200 μg/mL的ox-LDL，24 h后收集细胞进行后续实验。

1.3 质粒载体构建 根据人NORAD的序列，设计shRNA退火引物并合成共50μL的反应体系进行引物退火。利用质粒大量制备试剂盒提取目的质粒。根据实验设计的酶切位点对提取的质粒进行双酶切，电泳检测。退火产物与双酶切后的干扰载体片段连接。连接产物加入至感受态细胞中，在含有Amp的琼脂平板上培养，形成单菌落。挑选菌落，鉴定插入的片段，选取阳性克隆，制备菌保送测序。1.4 HUVECs的转染 将HUVECs接种于6孔板，分为阴性对照组、ox-LDL组、ox-LDL+shNC组、ox-LDL+shNORAD组。培养待贴壁。用Opti-MEN培养基分别稀释Lipofectamine2000、shNORAD和shNC。将已稀释的Lipofectamine2000溶液分别与shNORAD（NORAD的干扰RNA）、shNC（非特异性的干扰RNA）溶液混匀，室温孵育20 min，待用。参照Lipofectamine2000试剂盒说明书，ox-LDL+shNC组、ox-LDL+shNORAD组分别转染shNC、shNORAD，转染后继续培养48 h。ox-LDL组、ox-LDL+shNC组、ox-LDL+shNORAD组加入200μg/mL的ox-LDL处理24 h后进行后续试验。

1.5 HUVECs内NORAD表达检测 采用实时荧光定量PCR法。用TRIpure试剂分别提取1.2与1.4中各组HUVECs的总RNA，紫外分光光度计测定各样本的RNA浓度，计算逆转录所需的RNA体积。保证RNA上样量一致，以Oligo（dT）15和Random为引物，进行反转录以得到相应的cDNA。PCR的反应体系为20μL，其中包括1μL的cDNA模板，各0.5μL的上下游引物。lncRNA NORAD正向引物序列5'-GGAGAATCGCTTGAACT-3'，反向引物序列5'-CAAACACCCAATGAATAG-3'；β-actin正向引物序列5'-GGCACCCAGCACAATGAA-3'，反向引物序列5'-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3'。反应条件：94℃ 5 min，94℃ 15 s变性，60℃ 25 s退火，72℃30 s延伸。用2-ΔΔCt法计算NORAD相对表达量。

1.6 HUVECs内NF-κB p65、p-IκBα表达检测 采用Western blotting法。分别收集1.2与1.4中各组的HUVECs，用细胞裂解液于冰上充分裂解样本。开启冷冻离心机，12 000 r/min 4℃离心10 min，分离上清即为蛋白质提取物。BCA法测量提取的每组蛋白浓度。制备蛋白上样液，每孔含40μg蛋白。用SDS-PAGE电泳分离蛋白质后，将蛋白质转至PVDF膜。用TBST缓冲液配制5%脱脂奶粉，将PVDF膜置于脱脂奶粉中封闭1 h。在杂交袋内放入配制好的NF-κB p65、p-IκBα抗体工作液与封闭的PVDF膜，4℃过夜，孵育一抗。取出PVDF膜，TBST洗膜4次，每次5 min。然后将PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同于室温下孵育45 min。再次TBST洗膜6次，每次5 min。ECL化学发光试剂浸湿PVDF膜，暗室曝光。用凝胶图象处理系统分析目标条带的光密度值进行统计分析。

1.7 HUVECs内 IL-6、TNF-α、ICAM-1检测 采用ELISA法。用包被液稀释包被抗体至浓度为10μg/mL，4℃包被过夜。用PBST将IL-6、TNF-α与ICAM-1标准品分别从1 000 pg/mL开始做倍比稀释，浓度分别为 500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/mL。将稀释后的标准品各100μL，依次加入96孔板中，空白孔内加入1×PBST，样本孔内分别加入100μL阴性对照组、ox-LDL组、ox-LDL+shNC组、ox-LDL+shNORAD组的待测样本，37℃孵育2 h。甩掉孔内的液体，加入捕捉抗体100μL，37℃孵育1 h。用PBST洗板3次，每次2 min。加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素100μL，37℃孵育30 min。用PBST洗板5次，每次2 min。每孔内加入100μL的TMB显色液，37℃孵育15 min后加入终止液。酶标仪测定450 nm处的各孔OD值。以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据不同样本的OD值计算出相应的样本浓度。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism7.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组之间比较采用非配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度ox-LDL处理后HUVECs内NORAD的表达变化 阴性对照组、实验组1、实验组2、实验组3 NORAD的相对表达量分别为1.00±0.05、1.41±0.03、3.19±0.06、3.95±0.22，阴性对照组与实验组2、实验组3相比，实验组2与实验组3相比，P均＜0.05。

2.2 不同浓度ox-LDL处理HUVECs后NF-κB通路的变化 阴性对照组、实验组1、实验组2、实验组3 NF-κBp65的相对表达量分别为1.00± 0.04、1.90±0.05、2.98± 0.06、4.08± 0.03，p-IκBα的相对表达量分别为1.00±0.02、1.66±0.05、3.15±0.07、3.53±0.04，组间两两相比P均＜0.05。选择200μg/mL作为后续试验的ox-LDL浓度。

2.3 shNORAD的转染效率 阴性对照组、ox-LDL组、ox-LDL+shNC组、ox-LDL+shNORAD组中NORAD的相对表达量分别为1.00±0.02、4.01±0.21、3.94±0.16、0.76±0.01，ox-LDL+shNORAD组与ox-LDL+shNC组相比P＜0.05。

2.4 NORAD对NF-κB通路的调控作用 阴性对照组、ox-LDL组、ox-LDL+shNC组、ox-LDL+shNORAD组中NF-κB p65的相对表达量分别为1.00±0.05、3.93 ± 0.03、4.04 ± 0.04、3.05 ± 0.05，p-IκBα的相对表达量分别为1.00±0.02、3.60±0.08、3.49±0.09、2.89±0.06，ox-LDL+shNORAD组与ox-LDL+shNC组相比P＜0.05。

2.5 NORAD对HUVECs分泌功能的调控作用 阴性对照组、ox-LDL组、ox-LDL+shNC组、ox-LDL+shNORAD组中IL-6水平分别为（52.53±0.31）、（215.40 ± 0.39）、（218.30 ± 0.45）、（203.60 ±0.38）pg/mL，TNF-α水平分别为（45.75± 0.29）、（172.70 ± 0.34）、（168.40 ± 0.34）、（160.80 ±0.41）pg/mL，ICAM-1水平分别为（92.36± 0.65）、（318.20 ± 0.33）、（315.30 ± 0.33）、（297.90 ±0.83）pg/mL，阴性对照组与ox-LDL组相比，ox-LDL+shNORAD组与ox-LDL+shNC组相比，P均＜0.05。

3 讨论

内皮细胞功能障碍、氧化应激和慢性炎症共同诱发并维持AS的病变过程［3］。内皮细胞功能障碍发生在AS的早期，表现为抗炎、抗凝功能的变化以及调节血管舒缩能力的受损。而ox-LDL可以通过多种机制促进AS斑块的形成和发展，包括诱导内皮细胞功能障碍。ox-LDL可以介导内皮细胞的活化，通过上调单核细胞趋化蛋白1、IL-8、E-选择素、血管间黏附分子等趋化因子和黏附分子的表达，促进循环单核细胞黏附到血管内皮。ox-LDL可以减少内皮细胞释放血管舒张剂一氧化氮；通过消耗质膜微囊内的胆固醇取代内皮型一氧化氮，抑制一氧化氮的生成；以及促进活性氧的生成，灭活一氧化氮。ox-LDL还能够刺激内皮细胞产生内皮素、血管紧张素Ⅱ等血管收缩因子。ox-LDL激活caspase-9、caspase-3及Fas等凋亡因子，降低凋亡蛋白Bcl-2的表达，诱导内皮细胞的凋亡，促使血管对细胞和脂质的通透性增加。ox-LDL还可以诱导内皮细胞生成更多的ROS，介导氧化应激反应［4］。研究显示，NF-κB信号通路与内皮细胞功能障碍之间存在着关系。替格瑞洛和氯吡格雷可以通过抑制NF-κB信号通路，减轻LPS诱导的内皮细胞功能障碍［5］。另一项实验显示，富组氨酸糖蛋白通过抑制NF-κB信号通路的活性，减少TNF-α/LPS诱导的细胞因子释放，改善内皮细胞功能［6］。总之AS的治疗目前仍以调脂、预防血栓形成为主。但由于其发病机制是多方面的，当前的针对性治疗尚不能覆盖所有方面。进一步深入研究AS的发病机制，为治疗提供新的靶点和策略是临床医生的关注重点。lncRNA由于能够在表观遗传学水平上调控多种疾病的病理生理过程，其与AS的关系成为研究的热点。

随着基因技术的不断发展，人们逐渐意识到大约98%的基因组转录为非编码RNA。这些转录本中，长度超过200个碱基对的被称为lncRNA。lncRNA虽然无法编码蛋白质，但是越来越多的证据表明其在细胞分化、运动、凋亡以及基因表达模式的改变中起着关键作用［7-9］。lncRNA参与了多种心血管疾病的发病过程。lncRNA TCONS-00106987通过内源性竞争miRNA-26，诱导其靶基因KCNJ2的转录，促进电重构，从而增加内向整流K＋电流，缩短心房有效不应期，诱导房颤的发生［10］。lncRNA也参与了对缺血性心脏病的调节，FOXO3a通过促进lncRNA LINC00261的转录，下调miR-23b-3p的表达，提高NRF2的水平，减轻了缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡，改善了心功能［11］。lncRNA可通过多个方面调控AS的病理过程。CHI等［12］发 现，沉 默 lncRNA HOXA-AS3可 以 通 过 调控miR-455-5p/p27 Kip1轴，减轻ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡、生长抑制以及G1周期阻滞，从而抑制AS的进展。而另一lncRNA PEBP1P2则通过与CDK9结合，抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移和去分化，减轻AS病变［13］。目前为止有关lncRNA与AS之间关系的研究仍十分有限，进一步的机制研究很有必要。本实验试图从lncRNA对内皮细胞功能障碍的影响入手，揭示lncRNA对AS病理生理变化的影响。

NORAD通过阻断PUMILIO蛋白的作用来维持基因组的稳定性。由于其独特的特性，很快便成为研究的焦点。后续的研究表明，NORAD在不同类型的癌症中处于功能失调状态，并与癌症发生发展的几个关键过程有关，如细胞增殖、侵袭、转移和凋亡［14-15］。由于lncRNA参与了多种心血管疾病的病理生理过程，本实验拟探讨lncRNA NORAD在AS过程中的作用及潜在的分子机制。由于氧化应激反应是AS重要的始动和维持因素，因此本实验首先用ox-LDL构建细胞损伤模型，分别用 0、50、100、200μg/mL四种不同浓度的ox-LDL处理HUVECs 24 h。之后的检测发现，随着ox-LDL浓度的升高，NORAD在HUVECs中的表达也逐渐上调。由于NF-κB通路的异常与肿瘤、免疫反应、炎症等疾病相关，且其也参与了AS的过程。本实验接下来验证NF-κB通路在氧化应激情况下的变化，结果显示HUVECs中 NF-κB 通路的关键因子 NF-κB p65与p-IκBα的表达也随着ox-LDL浓度的增加而上调。因此选择了200μg/mL的ox-LDL继续后续实验。NORAD 可 参 与 NF-κB 信 号 通 路 的 调 节［16］，推 测NORAD可能通过对NF-κB通路的调节，影响内皮细胞的功能障碍。为了证实上述的假设，本实验构建了shNORAD质粒载体，并转染HUVECs以下调NORAD的表达，经过200μg/mL的ox-LDL处理后，与非特异性序列shNC转染的HUVECs相比，ox-LDL+shNORAD组NF-κB p65与p-IκBα表达下调。提示NORAD表达下调抑制了NF-κB通路的活性。内皮细胞功能障碍的表现之一为趋化因子、炎症因子分泌的异常。进一步实验显示，与阴性对照组相比，ox-LDL组HUVECs分泌的IL-6、TNF-α、ICAM-1水平升高，提示氧化应激加重了内皮细胞的功能障碍。转染后，与ox-LDL+shNC组相比，ox-LDL+shNORAD 组 HUVECs分泌的 IL-6、TNF-α、ICAM-1水平降低，提示在氧化应激的情况下，内皮细胞的功能障碍得到了部分的逆转。

综上所述，lncRNA NORAD表达下调可以减少氧化应激情况下内皮细胞分泌趋化因子与炎症因子，其可能是通过抑制NF-κB通路的活性发挥作用，可能成为AS新的诊断标志物和治疗靶点。