非酿酒酵母发酵海红果酒的特性研究

杨 辉， 王婷婷， 赵 敏， 苏 文， 董腾达， 黄莎莎

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

海红果为府谷县地理标志保护性水果，颜色呈鲜红色有轻微的涩味.主要分布在陕西、山西、内蒙古三省相邻地带，研究表明海红果具有一定的营养价值，其中包含丰富的矿物质、有机钙、多酚类、黄酮类物质等营养物质，经常食用具有抗衰老、预防心脑血管老化 、抑制脂肪堆积、减肥和防高血脂症等功效[1,2].海红果含糖18%左右，酸含量约11 g/L，是酿果酒的极好原料.

随着人们饮酒安全和健康意识的不断提高，即“高度酒向低度酒转变，蒸馏酒向酿造酒转变，粮食酒向水果酒转变”的饮酒三个转变更加深入人心[3].低度果酒不仅避免了酒精含量的过多摄入带来的危害，还满足了消费者对健康和营养的需求，因此，低度果酒深受消费者的喜爱.

市售海红果酒多由酿酒酵母发酵，虽然酿酒酵母具有耐高温，耐酒精的优点；但是果酒口感寡淡，香味不足，且采用酿酒酵母酿造低度酒，想要达到理想的低酒精度时，终止困难，从而影响了海红果酒的多样性[4].研究发现部分非酿酒酵母在发酵果酒时，可以降低果酒中的酒精含量，改善果酒的口感，丰富酒中的风味物质[5-8].非酿酒酵母主要包括柠檬形克勒克酵母、有孢汉生酵母和东方伊萨酵母等.其中，柠檬形克勒克酵母能形成更多的酯类物质，如带有香蕉味的乙酸异戊酯和带有玫瑰花香的乙酸苯乙酯[9-11]；柠檬形克勒克酵母和有孢汉生酵母易产生果胶酶，糖苷酶，蛋白酶等，产生的果胶酶可使果酒变澄清，β-葡萄糖苷酶可以提升酒中的香气[12-14]；东方伊萨酵母和有孢汉逊酵母能产生更多的高级醇等物质[15,16].因此将非酿酒酵母应用于海红果酒的酿造中，可以酿造出低酒精度、高品质、风格独特的果酒.

本实验选用两种不同类型的非酿酒酵母：柠檬形克勒克酵母和东方伊萨酵母，分别发酵海红果酒.在两种非酿酒酵母耐受性的研究基础上，对两种非酿酒酵母发酵海红果酒的发酵特性进行研究，为非酿酒酵母应用于海红果酒奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

东方伊萨酵母1344(Issatchenkiaorientalis)、柠檬形克勒克酵母31232(klockeraapiculata)：中国工业微生物菌种保藏中心，提供方式为冻干粉.

1.1.2 试剂

蛋白胨、琼脂粉、酵母浸粉、葡萄糖，北京奥博星生物技术有限公司；硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠、次甲基蓝(纯度≥98%)、酚酞、无水乙醇，天津市天力化学试剂有限公司；亚硫酸，天津市科密欧化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

pHS-3C型pH计，上海仪电科学器股份有限公司；PL-203电子天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司；SP-756P紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；WMK-08恒温培养箱，DSX-280B蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂.

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

将两种保藏的酵母冻干粉取少量加入含有2%葡萄糖的无菌水中，37 ℃恒温水浴复水25 min；取2%的菌悬液接种至YPD培养基上28 ℃培养24 h，稀释涂布于YPDA固体培养基上，28 ℃培养48 h，在YPDA固体培养基上选择菌落特征明显的菌株接种于YPD液体培养基中，于150 r/min、28 ℃条件下培养24 h制成种子液.

1.3.2 发酵培养基的制备

将海红果浓缩汁稀释3.5倍得到的与海红果鲜榨汁糖度相近的果汁，其可溶性固形物为20 °Brix，总酸为15.4 g/L，还原糖为159.46 g/L，pH 3.47.

1.3.3 两种非酿酒酵母对酒精的耐受性考察

将1.3.1节中活化好的两种非酿酒酵母种子液分别以2%的接种量接种于酒精体积分数0、2%、4%、6%、8%、10%的YPD液体培养基中，28 ℃条件下培养34 h左右，用蒸馏水调零，测定不同酒精体积分数下的非酿酒酵母的OD630值，并重复三次测定，依据不同酒精度下的OD630值考察非酿酒酵母的酒精耐受性.

1.3.4 两种非酿酒酵母对SO2的耐受性考察

将1.3.1节中活化好的两种非酿酒酵母种子液分别以2%的接种量接种于SO2质量浓度分别为0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L的YPD液体培养基中，28 ℃条件下培养34 h左右，用蒸馏水调零，测定不同SO2质量浓度下的OD630值.重复三次检测，依据不同SO2浓度下的OD630值考察非酿酒酵母的二氧化硫耐受性.

1.3.5 两种非酿酒酵母对糖的耐受性考察

将1.3.1节中活化好的两种非酿酒酵母种子液分别以2%的接种量接种于葡萄糖质量浓度分别为0、50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L的YPD液体培养基中，28 ℃条件下培养34 h左右，用蒸馏水调零.测定不同葡萄糖质量浓度下的非酿酒酵母的OD630值，重复三次测量，依据不同糖度下的OD630值考察非酿酒酵母的糖的耐受性.

1.3.6 发酵性能参数测定

将两种非酿酒酵母分别接种于海红果汁中，23 ℃培养8天，每隔24 h测发酵过程中还原糖，酒精度，总酸，酵母数量并分析其变化情况.

1.3.7 分析方法

(1)理化指标的测定[17]

还原糖测定采用斐林试剂法；总酸测定采用酸碱中和滴定法；酒精度的测定采用密度瓶法；pH值采用pH计法.

(2)酵母发酵性能

采用CO2失重法[18].每隔24 h称重一次，计算净质量，直至发酵结束.

(3)酵母计数

采用血球计数板计数.

2 结果与讨论

2.1 两种非酿酒酵母对酒精的耐受性

酒精度是低度果酒最重要的控制指标，酵母的酒精耐受性越高，得到的果酒酒精度越高.发酵液的OD值与酵母浓度或数量成正比.因此，OD630可用于表征酵母对酒精耐受性，亦可表示非酿酒酵母对二氧化硫和糖的耐受性.

图1是两种非酿酒酵母在不同酒精度下的菌体生长曲线，结果表明当酒精度≥4%vol时，柠檬形克勒克酵母的生长受到严重抑制，而东方伊萨酵母的生长影响偏小；当酒精度≥8%vol时，东方伊萨酵母的生长受到严重抑制，而柠檬形克勒克酵母几乎停止生长，逐渐走向衰亡期.

因此，东方伊萨酵母对酒精的耐受性为8%vol，而柠檬形克勒克酵母对酒精的耐受性为4%vol.基于上述分析，东方伊萨酵母适于酒精度为8%vol的果酒的酿造，而柠檬形克勒克酵母则适用于更低酒精度果酒的酿造.

图1 酒精度对非酿酒酵母生长的影响

2.2 两种非酿酒酵母对SO2的耐受性

果酒在发酵过程中，为防止杂菌污染发酵液中会加入SO2，虽然起到抗氧化和护色的作用，但是也会抑制酵母的生长，对发酵产生不良影响.图2为不同二氧化硫浓度下的非酿酒酵母菌体生长曲线，发酵液OD630值越高表明相应SO2浓度下，非酿酒酵母生长受到的拟制作用越小，结果表明当SO2质量浓度<100 mg/L时，两种酵母的生长受到抑制较小.当SO2质量浓度≥100 mg/L时，柠檬形克勒克酵母的生长受到严重抑制，酵母生长量大幅度下降，东方伊萨酵母的生长也受到一定的抑制，酵母生长量在逐渐减少.因此，两种非酿酒酵母发酵果酒时添加的SO2质量浓度应小于100 mg/L.

图2 SO2对非酿酒酵母生长的影响

2.3 两种非酿酒酵母对糖的耐受性

一般来说，水果中的糖含量为15 °Brix左右，采用留糖发酵生产低度酒，发酵结束后酒中糖含量在50 °Brix～100 °Brix，其口感好，广受消费者的青睐，如果酵母对糖的耐受性好，可以在较大范围调整发酵果汁中糖含量，可生产出不同糖度的低度果酒，满足各种不同糖度要求的消费者，同时提高了的销售的灵活性，因此，对两种非酿酒酵母的糖耐受性进行了考察.

市场调查发现，3%vol～8%vol的果酒广受欢迎，因而果汁中糖度最高控制在25 °Brix，在此条件下可以发酵得到酒精度为8%vol，糖度为124 g/L的甜型酒，糖度再高，其爽口性差.因此，考察两种非酿酒酵母糖耐受量最高值为250 g/L.

图3给出了不同初始糖度下两种非酿酒酵母的菌体生长曲线.从图中可得知，在葡萄糖浓度为250 g/L范围内两种非酿酒酵母都有较好的耐受性，说明两种非酿酒酵母均可用于糖度广泛的果酒酿造.

图3 葡萄糖对非酿酒酵母生长的影响

2.4 发酵性能参数的测定

2.4.1 非酿酒酵母发酵性能的测定

酵母在发酵过程中会产生大量二氧化碳，通过测定酵母发酵过程中二氧化碳的释放量来评价酵母的发酵性能.图4给出了发酵过程中二氧化碳释放量与时间的对应关系，反映了酵母菌发酵强度的变化.在发酵过程中，两种非酿酒酵母产生气泡较少，东方伊萨酵母与柠檬形克勒克酵母相比，东方伊萨酵母的发酵速率高于柠檬形克勒克酵母.柠檬形克勒克酵母在第4天后逐渐达到稳定状态，可能是因为发酵后期逐渐进入衰亡期；而东方伊萨酵母一直处于上升状态，表明发酵强度大，发酵能力强.

图4 非酿酒酵母发酵性能

2.4.2 发酵过程中还原糖含量和酒精度的变化

果酒的酒精发酵原理是果汁中含有的糖经过酵母产生的一系列酶的作用，经过复杂的化学变化，产生乙醇和二氧化碳.果汁中的葡萄糖和果糖直接被利用，而多糖经过分解酶和转化酶的作用生成单糖参与酒精发酵.

由图5(a)可以看出，两种酵母发酵海红果酒的还原糖含量随着发酵时间的延长而逐渐降低.东方伊萨酵母发酵的海红果酒从第2天开始还原糖含量大幅度降低，在发酵结束后还原糖含量达到85.4 g/L.柠檬形克勒克酵母发酵的海红果酒从第4天开始还原糖含量逐渐下降，发酵结束后达到84.1 g/L.

由图5(b)可知，东方伊萨酵母发酵的海红果酒酒精度高于柠檬形克勒克酵母发酵的海红果酒.从第5天开始两种酵母发酵的海红果酒酒精度开始大幅度提升，到第7天趋于平稳状态.对比海红果酒中的还原糖含量和酒精度变化趋势，第7天海红果酒中还原糖含量还在降低但酒精度已达到稳定，由此推断海红果酒在发酵时产生酒精的同时可能产生一些其他物质.发酵结束后两种非酿酒酵母果酒的糖度均在85 g/L左右，而酒精度分别为2.72%vol和2.44%vol，因此两种非酿酒酵母均可作为低度果酒的发酵剂.

(a)还原糖含量的变化

2.4.3 发酵过程中总酸含量和pH的变化

酸是果酒的骨架，缺酸的果酒酒体不丰满，立体感差，而酸度过高则对口感产生不良影响，pH是果酒质量重要的控制指标之一，一般来讲pH3～3.5的酒不仅可有效防止杂菌污染，同时具有很好的稳定性[19,20].

图6分别给出了发酵过程中总滴定酸和pH的变化.由图6(a)可知，非酿酒酵母发酵的海红果酒前期酸度降低，说明非酿酒酵母分解酸的能力大于产酸的能力；在第2天和第4天开始柠檬形克勒克酵母和东方伊萨酵母发酵的海红果酒总酸分别升高，则是因为该酵母在发酵时产生的二氧化碳较少，部分二氧化碳溶于发酵液中，产生乙酸等有机酸；在第3天和第6天后发酵液总酸分别开始下降，说明随着发酵速率逐渐加快，酒精度上升导致酸度降低；在第6天和第7天后发酵曲线呈现上下波动，是因为非酿酒酵母在发酵过程中产生有机酸的同时也在分解果酒中的有机酸.

由图6(b)可知，非酿酒酵母发酵的海红果酒发酵前期发酵液中葡萄糖被分解形成丙酮酸，丙酮酸转化成乙酰辅酶A，进而形成柠檬酸，异柠檬酸等有机酸[21]导致pH降低；第3天后发酵速率加快，酒精度升高，使酒中的有机酸降低，pH升高；第5天后发酵趋于稳定导致pH逐渐趋于稳定.

(a)总酸含量的变化

2.4.4 发酵过程中酵母数量的变化

为了进一步验证两种非酿酒酵母对酒精度的耐受性，对海红果低度酒发酵曲线进行了测定，其结果如图7所示.

由图7可知，海红果酒的酵母数量随着发酵时间的延长而增多.柠檬形克勒克酵母发酵的海红果酒在第7天酵母数量达到最大值，酒精度为2.4%vol，而东方伊萨酵母发酵的海红果酒在第6天酵母数量达到最大值，酒精度为2.28%vol.说明随着海红果酒酒精度的增长，两种酵母均受到了抑制，从而使酵母数量呈现下降趋势.但是由于东方伊萨酵母酒精耐受性高于柠檬形克勒克酵母，导致最终东方伊萨酵母发酵的海红果酒产生的酒精度高于柠檬形克勒克酵母.

图7 发酵过程中酵母数量的变化

3 结论

通过对两种非酿酒酵母耐受性及发酵特性的研究，得到以下结论：

东方伊萨酵母在不同酒精度和二氧化硫浓度下的耐受性高于柠檬形克勒克酵母；东方伊萨酵母发酵性能优于柠檬形克勒克酵母；两种非酿酒酵母均适于低度果酒的酿造，东方伊萨酵母发酵酒精度为2.72%vol，柠檬形克勒克酵母发酵酒精度为2.44%vol，基于对糖有很好的耐受性，二者均可酿造系列糖度的低度果酒.

综上，两种非酿酒酵母发酵海红果酒时均可酿造出低酒精度的果酒，经感官评价其中柠檬形克勒克酵母发酵的海红果酒比东方伊萨酵母发酵的海红果酒的果香味更浓郁.后期研究可分析检测酒中的香味物质，以此来分析非酿酒酵母提高海红果酒果香味的原因.