一株褐煤内源菌对平庄褐煤的溶解转化*

成建国 马力通，2 赵文渊 刘云颖 林 雨

(1.内蒙古科技大学化学与化工学院，014010 内蒙古包头；2.生物煤化工综合利用内蒙古自治区工程研究中心，014010 内蒙古包头；3.太原理工大学化学与化工学院，030024 太原)

0 引 言

煤炭是我国的主体能源和重要工业原料，据统计，2018年我国一次能源消费中原煤占69.1%[1]。然而，利用方式粗放，能效低、污染重是制约煤炭能源发展的瓶颈。特别是褐煤，其煤化程度低，挥发分含量高，直接燃烧热值低、污染严重，不能作为燃料直接燃烧使用[2-3]。我国褐煤资源丰富，储量占到全国煤炭总储量的13%，主要集中在内蒙古、云南和黑龙江等地区。因此，利用微生物降解转化褐煤，使其转化为清洁燃料和高值化学品的意义重大，为褐煤的高值利用提供了新途径[4-6]；并且微生物转化褐煤具有条件温和、能耗低、设备要求简单、绿色无污染等优点[7-9]。

利用微生物转化煤炭的研究始于20世纪80年代，COHEN et al[10]发现两株真菌可以将粉碎的褐煤溶解形成黑色液滴。之后学者们针对微生物溶解转化褐煤做了大量研究工作，结果表明一些真菌如青霉菌、曲霉、镰刀菌，细菌如假单胞菌、粪产碱菌、枯草芽孢杆菌及放线菌均有不同程度溶解转化低阶煤的能力，但溶煤效率低[11-13]。所以要实现利用微生物溶解转化褐煤制备高值化学品还需要进一步的深入研究，特别是对高效溶解转化褐煤微生物的筛选和驯化，以及如何控制化学品的定向转化研究。

在筛选可溶解转化褐煤的微生物过程中发现，存在于特定煤样中的内源微生物与外源微生物相比，其对煤样的溶解转化性能及适应性会更好。另外，褐煤是一种煤化程度较低的煤种，含有很多类木质素结构，与精煤相比更容易被微生物降解[7,14-15]。同时也有研究[16]表明预处理包括酸处理、碱处理等可以提高微生物对褐煤的溶解转化率。经过分离纯化和溶煤实验验证，笔者从内蒙古平庄褐煤中得到一株白色拟青霉HM-M5，其对酸处理后的褐煤有较好的溶解转化效果，并对其酶学性质特征、溶煤效果及溶解产物进行了研究。

1 实验部分

1.1 煤样和试剂

褐煤样品采自内蒙古平庄煤矿区，煤样的工业分析结果见表1。实验试剂二氯甲烷为色谱纯，愈创木酚、ABTS(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、藜芦醇、硝酸等均为分析纯。

表1 褐煤煤样的工业分析Table 1 Proximate analysis of lignite samples

1.2 菌株的分离筛选

取新采集的褐煤，用无菌水反复洗涤三次，将表面的微生物清洗干净，取50 g用研钵将其研磨成粉末，再取10 g煤粉于100 mL三角瓶中，加入50 mL无菌生理盐水振荡提取20 min，然后用稀释平板法进行微生物的分离筛选，培养基为PDA(Potato Dextrose Agar)，整个过程注意无菌操作。通过对分离出的微生物菌株进行溶煤测定，最终得到一株溶煤效果较好的霉菌，命名为HM-M5。

1.3 菌株HM-M5的酶学性质分析

以往研究[17-18]表明，白腐真菌引起木头白色腐朽的主要原因是白腐真菌可以分泌多种胞外过氧化物酶类，包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、过氧化氢酶、漆酶等。本研究从平庄褐煤中分离得到白色拟青霉HM-M5，在PDA培养基上其菌落周围滴加50%愈创木酚，愈创木酚可被氧化为茶褐色产物。然后分别以ABTS和藜芦醇为底物测定了该菌株胞外漆酶和木质素过氧化物酶的活性。同时分析了在PDA液体培养基中添加秸秆粉及酸处理褐煤对拟青霉分泌产生漆酶和木质素过氧化物酶活性的影响。

1.3.1 漆酶(Lac)活性测定

漆酶活性测定是评定漆酶性质以及确定漆酶稳定性的常用检测方法，测定酶活性的方法有多种，如愈创木酚法、丁香醛连氮法、邻联甲苯胺法和ABTS法等[19]。其中最准确合理的方法为ABTS法，漆酶可分解ABTS为ABTS自由基，在波长为420 nm处ABTS自由基的吸收系数远大于ABTS底物的吸收系数，且随着自由基浓度的增大，其吸光度也会增大。吸光度在一定变化范围所用的时间可反映生成ABTS自由基的速率即Lac活性，定义每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量为1个酶活力单位(U)[20-21]。测定条件：将2 mL 0.5 mmol/L的ABTS底物、1 mL粗酶液加入1 mL 0.1 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0)，于40 ℃下混匀，在420 nm下测定吸光度从0.15增加到0.20所用的时间t。漆酶活性计算公式为：

ZLac=V×α×ΔA×60×D/Δt

式中：ZLac为Lac活性，U/L；V为溶液体积，V=1 000 mL；α为ABTS自由基在420 nm处的吸收系数，为0.184 4；ΔA为吸光度由0.15增加到0.20的差值，ΔA=0.05；D为稀释倍数；t为吸光度从0.15增加到0.20所用的时间，s。

1.3.2 木质素过氧化物酶(Lip)活性测定

测定木质素过氧化物酶常用的底物为藜芦醇[22]。预先配制250 mmol/L pH 3.0的酒石酸缓冲溶液、20 mmol/L的H2O2、10 mmol/L的藜芦醇溶液。在1 mL的反应体系中加入0.2 mL藜芦醇溶液、0.4 mL酒石酸缓冲液、0.4 mL粗酶液、20 μL H2O2，混匀后于30 ℃水浴条件下反应5 min，用分光光度计测定310 nm波长下吸光度变化ΔA，定义1 min内吸光度变化0.01为一个酶活力单位。Lip活性计算公式为：

ZLip=ΔA×D/(0.01×Δt)

式中：ZLip为Lip活性，U/L；ΔA为5 min～10 min吸光度的变化值；Δt为测量吸光度的时间间隔，s；D为稀释倍数。

1.4 菌株HM-M5的鉴定

将菌丝接种于PDA平板上，于28 ℃培养3 d～4 d，观察记录菌落特征，并用光学显微镜观察菌丝和孢子丝，参照《真菌鉴定手册》进行分类鉴定。将菌丝接种于30 mL PDA液体培养基中，振荡培养4 d，用10 mL灭过菌的离心管于1 000 r/min，4 ℃离心10 min，取沉淀菌丝，用无菌水反应洗涤和重复离心3次，将菌丝利用改进CTAB法提取总DNA[23]，采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)进行PCR扩增，PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer K 2.0 μL，5U Ex Taq 0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 1.6 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 13.7 μL。PCR扩增条件为DNA变性处理：95 ℃，15 min；扩增阶段：95 ℃，30 s→56 ℃，30 s→72 ℃，90 s，循环25次，72 ℃延伸10 min，ITS扩增后用1%琼脂糖凝胶进行电泳纯化。电压为120 V，电泳30 min，扩增纯化后的ITS序列由上海美吉生物公司进行测序，序列信息提交Gen Bank数据库进行比对，获得相似序列的物种信息，借助同源比对的方法辅助判断物种信息，并构建系统发育树进行鉴定。

1.5 褐煤的预处理

先用球磨机将褐煤粉碎，取粒径在0.08 mm～0.10 mm的褐煤样品作为实验对象，加入去离子水反复洗涤去掉小颗粒煤粉，将处理过的煤样于80 ℃烘干。用6 mol/L硝酸对煤样进行酸化处理24 h，期间每隔1 h用玻璃棒搅拌一次，使煤粉与酸液充分反应。最后用去离子水对酸化处理后褐煤进行反复洗涤至pH呈中性(6.5～7.0)，80 ℃下烘干备用。

1.6 菌株HM-M5对褐煤溶解特性分析

固体培养条件下溶煤实验：将40 mL PDA培养基置于200 mL组培瓶中，于121 ℃下灭菌20 min，凝固后将分离的拟青霉接种于固体培养基表面，于30 ℃下培养，待菌丝完全覆盖培养基表面后，取0.5 g酸处理褐煤撒在菌丝表面，然后于30 ℃下继续培养，并记录生长和溶煤情况。

液体溶煤实验：取12个250 mL三角瓶，分别装入100 mL PDA液体培养基，自然pH。灭菌冷却后取6个三角瓶(剩余6个用于对照组，测定酸处理褐煤自然溶解效果)，将分离的拟青霉接种于三角瓶中，于30 ℃，120 r/min条件下振荡培养2 d待培养液中布满菌丝球，然后各个实验组和对照组中加入5.0 g烘干的酸处理褐煤继续培养，测定20 d内溶煤效果，中间不断取样将菌丝与褐煤样分离，测定褐煤溶解率。

1.7 扫描电子显微镜分析

利用Tescan公司GAIA3 SEM双束场发射扫描电子显微镜进行煤样表观形貌的分析。取微生物降解前后的烘干煤样，用无水乙醇将其清洗和分散，待自然挥发晾干后，用导电胶固定，经过表面喷金后进行扫描电子显微镜分析，观察拟青霉降解后褐煤表观结构的变化[24]。

1.8 褐煤降解产物分析

将拟青霉降解后的褐煤培养液用二氯甲烷进行液-液萃取，对有机相进行浓缩后加入一定量无水硫酸钠进行脱水处理2 h，再用0.45 μm有机系滤膜进行过滤，然后利用Agilent公司GC-MS(7890B-7000C)分析降解产物[25]。将得到的产物质谱总离子流图在NIST14质谱数据库中进行对比和匹配，确定不同降解产物的种类和名称。

2 结果与讨论

2.1 菌株HM-M5酶学性质特征

漆酶(Lac)和木质素过氧化物酶(Lip)是促进微生物溶解转化褐煤的关键胞外酶，其表达量和酶活性对褐煤的溶解转化具有重要作用。在固体平板其菌落周围滴加50%愈创木酚，30 min后HM-MS可将愈创木酚氧化为茶褐色物质(见图1b)，表明分离的拟青霉有较强的分泌胞外过氧化物酶的能力。

将拟青霉液体培养物分成3组，分别在500 mL三角瓶中装入300 mL PDA液体培养基，其中在第一组PDA培养基中不添加其他物质(对照组)，在第二组PDA培养基中加入0.5 g秸秆粉，在第三组PDA培养基中加入0.5 g酸处理褐煤煤粉，然后灭菌，冷却后接入1 mL液体培养的拟青霉菌液，置于30 ℃恒温振荡器中培养，不同时间取样测定胞外酶活性。拟青霉在不同培养条件下Lac和Lip活性变化如图2所示。由图2可以看出，拟青霉具有较强的Lac和Lip活性。由图2a可知，在第一组实验中不添加秸秆粉和酸处理褐煤，培养到第8天时Lac活性最高，可达到1 170 U/L，然后随着培养时间的继续延长，酶活性开始降低；添加秸秆粉和酸处理褐煤均可以促进拟青霉分泌产生Lac，且加入秸秆粉和酸处理褐煤后拟青霉产生Lac相对滞后，培养第8天时加入秸秆粉的实验组中Lac活性为733 U/L，加入酸处理褐煤的实验组中Lac活性为352 U/L。然后随着培养时间的延长，加入秸秆粉和酸处理褐煤的实验组中Lac活性继续增加，加入秸秆粉的实验组在第12天时Lac活性达到最高，为2 640 U/L，继续延长培养时间，Lac活性开始缓慢下降；加入酸处理褐煤的实验组培养第11天Lac活性最高，可达到1 920 U/L，继续延长培养时间，Lac活性开始迅速下降，第14天时下降到470 U/L，与第11天相比酶活性降低了75.5%。

图1 HM-M5对愈创木酚氧化结果Fig.1 Oxidation result of guaiacol by HM-M5a—Control；b—Experimental

由图2b可知，加入秸秆粉和酸处理褐煤同样可以诱导拟青霉产生更多的Lip，不添加秸秆粉和酸处理褐煤时，培养第9天生成的Lip活性最高，为6 300 U/L，继续培养到14天时Lip活性变化较小；加入秸秆粉和酸处理褐煤的实验组Lip活性最高值均大于对照组Lip活性最高值，加入秸秆粉的实验组培养第10天时Lip活性达到最高，为25 700 U/L，继续培养Lip活性开始下降；加入酸处理褐煤的实验组Lip活性在第11天达到最大值，为16 100 U/L，在培养12 d之后培养液中Lip活性迅速降低，第14天时降低到7 570 U/L，与第11天相比酶活性降低了53.0%。

分析拟青霉胞外过氧化物酶活性测定结果认为，拟青霉分泌胞外过氧化物酶类与生长环境中营养物质含量和形态有直接关系，在一开始PDA培养基中含有大量的糖类如淀粉、葡萄糖，可作为拟青霉直接利用的营养物质，可被细胞分泌的淀粉酶快速分解，为菌体生长提供营养物质，这个过程菌体分泌产生的过氧化物酶包括Lac和Lip较少。随着培养时间的延长，培养基内直接营养物质消耗殆尽，拟青霉被诱导合成大量的胞外过氧化物酶(Lac/Lip)用于分解环境中较难利用的营养物质如木质纤维素、腐植酸等，将其分解为细胞可直接利用的碳源营养物质，供菌体正常生长。

培养12 d以后，Lac和Lip活性降低，这是由Lac和Lip对木质素结构降解生成的一些酚类或芳香类有毒物质的积累对酶活性和拟青霉细胞有一定抑制作用导致的，或者培养环境中可利用营养物质消耗殆尽导致拟青霉细胞代谢能力下降。

图2 不同培养条件下HM-M5胞外过氧化物酶分泌情况Fig.2 Results of extracellular peroxidase activity of HN-M5 in different conditionsa—Lac activity；b—Lip activity□—PDA；○—PDA+straw；△—PDA+acid treated lignite

2.2 菌株HM-M5的描述与鉴定

在PDA平板上培养3 d，菌落为直径2 cm～3 cm的近似圆形，呈白色绒毛状，中间凸起边缘整齐，菌丝致密不易挑取，该菌分生孢子梗侧生无隔膜，菌丝透明成分枝状，表面光滑，分枝菌丝明显变细，在分枝菌丝头部形成球形子囊孢子，孢子囊和孢子均呈透明状，孢子为长椭圆形或者近似菱形(如图3所示)。在三角瓶中液体培养时可形成直径3 mm～5 mm白色绒状菌丝球，对固体颗粒有较强吸附性。将经过上海美吉生物公司测序获得的ITS序列提交Gen Bank数据库，得到的登录号为AB604005.1，将该序列与数据库中已知真菌序列进行BLAST对比检索，并构建系统发育树(见图4)。由图4可知，菌株HM-M5与Simplicilliumlanosoniveum亲源性最近，基因系列同源度高达95%，因此结合形态学分析和基因鉴定结果最终将分离的菌株HM-M5鉴定为白色拟青霉(Simplicilliumlanosoniveum)。

图3 菌株HM-M5显微镜镜检结果Fig.3 Results of microscopic examination of the strain HM-M5a—Mycelial morphology；b—Spore morphology

图4 菌株HM-M5基于rDNA ITS-1/ITS-4序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on analysis of rDNA ITS-1/ITS-4 sequences of strain HM-M5

2.3 菌株HM-M5对褐煤的溶解效果

拟青霉在固体平板培养基内部溶解褐煤效果如图5所示。先将拟青霉接种于PDA固体琼脂表面，于30 ℃下培养3 d～4 d，待菌丝覆盖培养基表面后，称取0.5 g酸处理褐煤撒在菌丝表面，然后继续培养1 d～2 d，观察发现菌丝可以在酸处理褐煤煤粉表面生长，继续培养10 d～15 d后在菌丝表面以及固体琼脂内部均有棕褐色褐煤溶解液渗出，表明褐煤颗粒在拟青霉作用下发生了溶解。

在液体培养条件下，拟青霉对褐煤的溶解效果见表2。由表2可以看出，在未接拟青霉的无菌培养基内加入5 g酸处理褐煤，30 ℃振荡提取20 d褐煤的自溶效果较差，仅为4.4%；在含有拟青霉菌丝的液体培养基中加入5 g酸处理褐煤，拟青霉对褐煤的溶解从第8天开始比较显著，连续培养20 d，最终对褐煤的溶解率可达到66.2%，溶煤效果显著。结合2.1节中Lac和Lip活性变化特征分析，表明胞外过氧化物酶类的分泌可以促进酸处理褐煤的溶解。

图5 固体平板内HM-M5对褐煤溶解效果Fig.5 Dissolving effect of lignite on solid medium by HM-M5a—Day 1；b—Day 3；c—Day 15

2.4 扫描电子显微镜分析

采用扫描电子显微镜分别对原褐煤、酸处理褐煤及拟青霉溶解后的褐煤进行表观分析，结果如图6所示。由图6a和图6d可以看出，未经预处理的褐煤表面平整光滑，裂纹和孔隙较少。

表2 菌株HM-M5对褐煤的溶解Table 2 Dissolution of lignite by HM-M5

由图6b和图6e可以看出，经6 mol/L硝酸处理的褐煤表面裂纹增多，粗糙度增加，在褐煤表面和内部的孔隙增多，而且经过硝酸氧化处理后褐煤的含氧基团增多也一定程度增加了褐煤的亲水性，牛晨凯等[24]研究也表明煤样含氧极性基团多少是反映煤炭亲水性的重要指标。因此，硝酸处理利于微生物及过氧化物酶进入褐煤内部对其进行溶解转化。由图6c和图6f可以看出，与未经过拟青霉处理的褐煤相比，拟青霉溶解转化后的褐煤表面变得褶皱不平，在表面及孔隙内部附着有大量的微生物细胞，孔隙增多说明微生物进入褐煤内部，在微生物分泌胞外酶作用下进一步促进了褐煤的溶解。可见拟青霉可以很好地附着于酸处理褐煤表面生长，利用其分泌的胞外酶将酸处理褐煤溶解转化，部分溶解产物作为营养物质供拟青霉生长，一些较难利用的溶解产物如芳香环类物质继续留在培养液中，为利用微生物溶解转化褐煤，从溶解液中提取有用化学品提供了可能。

图6 煤样的扫描电镜照片Fig.6 SEM photos of lignite samplesa,d—Raw lignite；b,e—Acid treated lignite；c,f—Lignite degradated by HM-M5；a,b,c—Magnified 2.5 thousand times；d,e,f—Magnified 20 thousand times

2.5 褐煤溶解液组成分析

以二氯甲烷为萃取剂，分别对褐煤自然溶解样品和拟青霉菌溶解褐煤产物进行萃取，并将有机相提取物利用GC-MS进行分析，结果如图7所示。由图7可知，褐煤自然溶解液经过萃取，检测到一种溶解产物1-甲基-7-(1-甲基乙基)菲，且其含量远低于其在菌株HM-M5溶解转化褐煤样品中的含量。HM-M5溶解转化褐煤样品，经过液-液萃取共得到4种主要产物，将其与NIST14质谱数据库匹配，分别为：1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)萘、邻苯二甲酸辛二酯、7-异丙基-1,1,4a-三甲基-1,2,3,4,4a, 9,10,10a-八氢菲、1-甲基-7-(1-甲基乙基)菲。4种产物的相对含量占总萃取物含量的91.4%(以峰面积计算相对含量)，其中1-甲基-7-(1-甲基乙基)菲相对含量最高，为41.1%。菲是一种重要的化工原料中间体，可用于制造农药、燃料和炸药稳定剂，邻苯二甲酸辛二酯是一种重要的高分子材料增塑剂，萘类化合物是合成邻苯二甲酸酐的重要中间体。此外，在溶解液中未检测到单链有机化合物，说明拟青霉可利用的营养物质范围较广，一些单链烃类、醇类、有机酸等均可作为拟青霉菌的碳源被利用，而单环和多环芳烃类如邻苯二甲酸酯类、萘类、菲类等不能被拟青霉利用，残留在溶解液中。从提取物分析结果看，利用拟青霉溶解转化褐煤制备有用化学品是一种可行的高值利用褐煤的途径。

图7 褐煤溶解液GC-MS分析结果Fig.7 Analysis results of lignite solution by GC-MS

表3 褐煤溶解转化产物与NIST14数据库匹配结果Table 3 Matching results for lignite dissolved products with NIST14 database

3 结 论

1) 在秸秆粉和酸处理褐煤诱导条件下，拟青霉具有较强的分泌胞外过氧化物酶的能力，特别是在环境营养物质贫乏的环境中，会促进拟青霉分泌胞外过氧化物酶类包括漆酶和木质素过氧化物酶等，对环境中存在的难利用有机碳如木质素、褐煤等进行降解，转化为可被微生物利用的碳源为其生长提供营养物质。因此，拟青霉对酸处理褐煤的溶解转化与其分泌的漆酶和木质素过氧化物酶有直接关系。

2) 拟青霉对酸处理褐煤有较强的溶解转化能力，经过酸处理的褐煤其表面出现较多的裂纹和孔隙，为拟青霉菌丝的附着生长和过氧化物酶的接触氧化降解提供了有利条件，在液体培养条件下处理20 d菌株对酸处理褐煤溶解转化率可达到66.2%。通过扫描电子显微镜观察，经过拟青霉溶剂转化后，残留煤渣变得褶皱、多孔且空隙内有大量微生物细胞附着生长，表明拟青霉可以侵入褐煤内部通过分泌胞外酶将褐煤溶解转化。

3) 与褐煤的化学或者热溶解不同，微生物溶解褐煤后会将部分褐煤溶解物包括单链小分子有机物如烃类、有机酸类、酮类、含氮含硫小分子有机物等作为碳源和营养物质供自身生长，而最终经过溶解转化形成的一些难以被微生物利用的多环芳烃物质如邻苯二甲酸酯类、萘、菲等会残留在溶解液中，这些物质都是重要的化工原料，可用来制备增塑剂、农药、染料等。

4) 拟青霉HM-M5属于半知菌亚门，对环境适应性强，对营养物质要求较低，且有较强的分泌产生胞外过氧化物酶能力，是一种理想的溶解转化褐煤的微生物，随着生物技术的发展，利用微生物溶解转化褐煤存在巨大潜力。

5) 该褐煤内源真菌菌株HM-M5具有对褐煤环境适应性强、溶解转化褐煤效率高、转化产物种类少易于分离纯化和工业化的优点，是理想的溶解转化褐煤制备高值化学品的工业微生物。要实现利用该菌株制备高值化学品的工业化，还需进一步优化微生物溶解褐煤条件和研究产物的分离纯化方法。