基于网络药理学探析连花清瘟胶囊抗病毒物质基础

柏小辉, 蒋 丽, 吴 震, 戴新刚, 陈亚敏

(溧阳市中医医院，江苏 溧阳 213300)

流感疾病是由流感病毒引起的一种急性呼吸道感染类疾病，其发病率和死亡率均较高，易感人群为儿童等身体体质较弱人群。因流感疾病病毒的抗原变异速度比较快，导致人类特异性免疫不能及时识别变异后的流感病毒抗原，因此流感很容易爆发和流行，给人类生活及健康带来了极大的威胁和挑战[1]。连花清瘟胶囊(LHQW)主要由连翘、金银花、板蓝根等13味中药材药物组成，临床用于缓解咳嗽、流涕、发烧等病毒类感冒症状，临床使用疗效确切显著，应用效果较好[2]。考虑到病毒在宿主细胞内要成功的复制需要宿主细胞的细胞因子通路网络参与，对其抗病毒疾病网络复杂作用机制的研究有助于相关抗病毒新药研究与开发[3-4]。因此，为深入探析LHQW抗病毒物质基础，为后续抗流感病毒先导物发现和结构修饰提供相应启示，本文拟综合运用网络药理学和分子对接虚拟筛选技术等生物信息学相关技术，在系统网络层面上整体研究LHQW组方活性组分与抗病毒疾病网络核心靶点信号通路之间关联。

1 材料与方法

1.1 LHQW组方活性成分筛选与优化

分别以连翘、金银花、板南根等13味中药材药物检索词，分别选择中药系统药理学(TCMSP，http://tcmspw.com/TCMSP.php)、中药百科(Http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM)和中药化学数据库(http://www.chemtcm.com)等3个中药材活性组分数据库，结合现有文献数据挖掘和收集，去除重复，建立LHQW组方组分小分子数据库。对构建的组方小分子数据库以口服生物利用度(OB)和类药性(DL)两个药效学指标参数进行对组分小分子数据库中活性成分进行筛选(阈值条件：OB≥30%，DL≥0.18)[5]，构建筛选后LHQW组方组分活性成分数据库。此外，通过Drugbank 数据库(www.drugbank.ca/)，结合现有文献数据，搜寻现有具有抗流感病毒作用的阳性药。

1.2 LHQW组方筛选成分-靶标网络构建和分析

以筛选后的LHQW活性组分化合物结构为检索对象，利用SwissTargetPrediction数据库(Http://www.swisstargetprediction.ch/)，检索经药效学参数筛选后的LHQW组方活性成分-药物潜在靶点群。接下来，选用Cytoscape 3.2.1构建化合物-蛋白宏观互作网络效应图，从整体水平上解析LHQW组方治疗疾病的分子机制，以考察中药组方活性成分-药物与流感病毒疾病网络的关联度[6-7]。

1.3 疾病蛋白相互作用网络

采用上述SwissTargetPrediction数据库，以Drugbank 数据库搜集的抗病毒阳性药物为检索对象，反向预测LHQW组方活性成分-阳性药物两者潜在交集靶点。将抗病毒阳性药物疾病网络的致病基因映射到LHQW活性成分潜在靶标网络中，最后取两者交联的核心节点疾病靶标。

1.4 核心疾病靶标网络通路富集分析

选用Funrich(Http://www.funrich.org/)和David(Https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)两个生物信息学平台，对核心靶标进行GO(gene ontology)和 KEGG 通路 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析，以解析针对流感病毒致病基因核心靶标功能以及在疾病信号通路中的作用。

1.5 活性成分-核心疾病靶标虚拟筛选及网络分析

对活性分子与预测靶标利用薛定谔虚拟筛选平台Maestro进行抗病毒受体-活性成分配体对接模拟筛选。并根据打分函数的评价，对LHQW组方活性分子与流感疾病核心靶标互作的强弱依次进行排序。最后选用Cytoscape对活性成分-核心疾病靶标虚拟筛选结果-核心靶标信号通路三者之间进行网络可视化表征，目的是筛选及验证LHQW组方筛选组分与流感疾病网络核心靶点群之间关联。

2 结果与分析

2.1 小分子成分数据库构建

经过中药活性成分数据库检索和相关文献挖掘，分别从LHQW组方组方中金银花、连翘、石膏、大黄等中药材分别检索到1 742个化合物，经ADME特性OB和DL指标筛选后，分别从上述中药材筛选得到270个化合物。分别构建的组方小分子与阳性药物数据库化学描述符主成分分析结果详见图1，结果显示各组间呈在化学空间层面聚集程度较高，呈多样性化学空间分布排列，表明筛选后的LHQW组方组方成分在类药性方面与现有的阳性药物间存在较大的差距，具有较好的结构多样性，为后续先导物筛选及优化提供了较好的启示和参考。

2.2 活性成分-阳性药物-疾病互作潜在靶点

通过对活性成分-阳性药物-疾病三者进行相似性检索，得到了LHQW组方抗病毒靶点互作网络(图2),共有IL6R等6个靶点蛋白[8]。

图1 组方小分子与阳性药物化学信息学比较

2.3 GO与KEGG通路富集分析

通路富集分析结果显示，IL6R等6个蛋白GO富集分析共获得314条GO条目，KEGG富集分析结果共获得37条KEGG条目，利用Funrich、David数据库和Cluego插件的可视化分析，对流感疾病核心靶点进行富集，结果显示生物过程、分子功能、细胞成分等分别与细胞对有机物的反应、蛋白质结合、细胞外空间等有关，KEGG分析与细胞因子与细胞因子受体的相互作用等有关(表1)。

表1 6个抗流感疾病核心靶点KEGG富集分析结果

2.4 活性成分-核心疾病靶标虚拟筛选及网络分析

活性成分-核心疾病靶标虚拟筛选结果显示，每个抗病毒核心疾病靶标蛋白均有数量较多的LHQW活性组分化合物与其应答(98个化合物分子及以上)，其中与F2蛋白由潜在结合效应的分子多达203个。绝大多数的LHQW组方活性分子均集中作用于核心节点靶标蛋白, 提示这些响应应答可能是抗病毒的关键靶标和关键分子，为LHQW抗病毒药效物质基础[9]。将组方活性成分、核心作用靶点分别导入 Cytoscape 3.2.1软件中构建“LHQW组方活性成分-核心靶点-疾病通路”网络，可以看出LHQW组方的多成分、多通路、多靶点的作用特点，为解析其抗病毒作用机制提供了相关的思路。

3 结论与讨论

相关研究表明表明，中药(中药材)在清除感染病毒抗原、调节机体免疫和保护组织器官等方面都发挥着重要作用，对于流感等感染类疾病诊治及预后起到了较好的效果[10-11]，本研究应用网络药理学和分子对接的方法对LHQW中化学成分、核心活性化合物及其作用靶点进行了探索性研究[12]，并通过Cytoscape3.2.1构建“LHQW组方活性成分-核心靶点-疾病通路”网络[13]。相关研究显示LHQW组方内筛选出来的IL6R等6个蛋白在抗病毒感染、改善疾病网络炎症因子瀑布效应和提升机体免疫力等方面具有较好的作用。基于以上临床前期研究以及网络药理学分析，初步解释了LHQW抗流感病毒的药效物质基础，但是有关其具体的分子作用机制仍然需要通过进一步的实验验证[14]。