异种脱细胞基质支架移植修补膀胱的研究

邓 飞， 胡帼颖， 顾汉卿

(1.北京市顺义区医院泌尿外科， 北京 101300；2.天津市泌尿外科研究所， 天津 300211)

由肿瘤、结核等原因引起的膀胱大面积缺损一直是临床难题，现在多采用肠管(回肠、结肠)替代膀胱。但是胃肠道组织，不可避免地存在代谢异常、分泌肠液、感染、尿路结石、随时间推移发生挛缩等一系列并发症。 近年来，各种各样生物可降解支架材料，特别是异体脱细胞基质支架以其低抗原性，种属差异小，更符合生理特性，引起了研究者的重视，被研制开发并成功用于动物实验模型进行膀胱修补替代〔1〕。以胶原为主要成分构成的异体脱细胞基质支架除了起着支持、连接细胞的作用外,还为细胞的生长、代谢提供场所,并对细胞生长、代谢起重要的调节作用。将其作为宿主细胞生长的载体,完成对缺损组织的修复,是近年来组织工程学的重大进展〔2〕。 猪膀胱脱细胞基质(bladder acellular matrix，BAM)和猪真皮脱细胞基质(dermal acelluar matrix，DAM)是利用生物酶和相关试剂除去膀胱、真皮组织中的细胞和细胞碎片，留下细胞外基质，成为无细胞和富含胶原、弹性蛋白、平滑肌结构、血管框架的基质。这种材料具有良好的生物相容性和机械稳定性，免疫原性相对较低，从而为细胞再生提供了一个良好的支架，营造了细胞再生时优良微环境，作为细胞支架用于新生膀胱组织的生长替代重建，完成膀胱缺损的修复，执行膀胱的储尿和排尿功能〔3〕。 本实验之前制备了猪DAM和BAM这两种基质，利用病理切片，证实基质中无细胞及细胞碎片，只留下细胞外基质成分，成为异种生物支架。实验中支架植入实验兔的膀胱缺损处，观察不同时期膀胱标本，了解膀胱组织再生情况，检验支架的植入效果。

1 材料和方法

1.1 异种支架的制备

1.1.1 猪DAM制备方法 小型实验猪真皮断层皮片，约4 cm×6 cm，使用0.125%胰蛋白酶溶液，在4℃，经过24 h脱去真皮细胞，0.5% SDS振荡洗涤3 h清除细胞碎片。储存在0.1%叠氮钠-PBS溶液中，加入双抗溶液，密封，4℃保存。

1.1.2 猪BAM制备方法 小型实验猪膀胱刮去粘膜后保留粘膜下层组织，切成3 cm×3 cm片断，放在含有2000 kU DNAse及2000 kU RNAse的1 M NaCl 200 mL溶液中，37℃，搅动10 h，PBS溶液反复冲洗后放在 100 mL 4%脱氧胆酸钠溶液清除细胞碎片，37℃，搅动10 h，共进行两次。储存在0.1%叠氮钠-PBS溶液中, 加入双抗溶液，密封，4℃保存。

1.2 实验动物

正常健康经严格检疫的大耳白兔48只，雄性，体重(2.5±0.5)kg，由天津医科大学动物实验中心提供。

1.3 移植手术过程

手术在天津市泌尿外科研究所动物手术室进行。48只白兔采用随机分组为3组并编号，每组16只。实验组1为DAM支架组；实验组2为BAM支架组；其余为对照组。 实验当天，兔子禁食、禁水，放入兔盒中，使用氯胺酮注射液和安定注射液1∶1混合液静脉麻醉，按照1 mL/kg剂量从兔耳静脉注射。麻醉后的兔子放在手术台上，仰卧位，四肢用绑带固定，调整好手术灯光，剪去兔子下腹部正中区域的兔毛。按外科手术的要求，术者穿上手术衣，戴上无菌手套，以2%碘酊和75%的酒精消毒，铺无菌巾。取下腹部正中切口，切开毛皮，皮下组织及腹直肌，出血用细丝线结扎，彻底止血。从两侧拉开腹直肌，提起下方的腹膜，尖刀切一小口，进入腹腔。剪开腹膜，分开肠管，在盆腔找到膀胱，用空针穿刺膀胱，抽出黄色较浓的液体，有兔尿气味。选择膀胱顶端血管分布较少的区域进行，横向剪一长约3 cm的切口，做成膀胱缺损模型。 实验组1用猪DAM基质支架修补；实验组2用猪BAM基质支架修补；对照组，直接缝合膀胱切口。使用3-0的羊肠可吸收线缝合膀胱切口。实验组1和实验组2的支架边缘与膀胱切缘间断缝合，基质大小约2.5 cm×2.5 cm。四周缝合完毕后，用细针从膀胱下方穿入，注射生理盐水充盈膀胱，漏水处给予加固缝合，并且在缝合处上下方缝合黑色丝线作为标记。检查腹腔内的脏器无受损后，关闭腹腔，逐层缝合切口，手术结束。手术时间大约1 h。兔子麻醉苏醒后，放回动物房饲养，手术在2周内完成。手术步骤见图1.1～图1.6。

图1.1 麻醉

图1.2 穿刺抽尿

图1.3 选取移植部位

图1.4 准备移植

图1.5 缝合

图1.6 缝合完毕

2 结果

2.1 实验设计

48只兔子完成手术，术后注射青霉素1周抗感染，当有拉稀屎时，从口中灌注庆大霉素治疗。每日观察兔子的生长情况，精神状态，饮食情况，排尿排便情况。 实验设计：术后1、2、3周，1、2、3个月6个时间点使用气栓法处死各组兔子，每组2只，共36只。处死后立即解剖，检查腹腔内脏器有无病变，观察并取出膀胱，顺黑色的标记线找到缝合处，观察形态、大小、颜色、瘢痕情况。切取缝合处膀胱组织作为标本，行病理切片检查。 死亡情况：实验组1：3只； 实验组2：3只；对照组：3只。因能完成实验设计，死亡兔子不影响实验结果。死亡原因主要是感染，其次为手术并发症：膀胱破裂漏尿，出血等。

2.2 观察膀胱标本情况

1周的膀胱标本支架与膀胱缝合处无特殊变化，缝线清晰可见。2周的标本缝合处与周边膀胱组织的界限模糊，支架开始收缩，面积减小。3周的标本缝合处支架形成瘢痕组织，实验组2比实验组1要明显。 1个月的标本很难找到缝合处，缝合的羊肠线吸收，需借助黑色的标记线寻找，缝合处抗张力强度较弱。 2个月的标本可见支架逐渐被新生的膀胱组织取代，已修复如正常的膀胱外观。同时2只支架内腔面发现了结石颗粒。1只为实验组1，2只为实验组2。 3个月的标本已经找不到支架，支架已经吸收的膀胱壁比较厚实。支架内表面光滑，有肉眼可见的血管网，外表面触之较粗糙。对照组的标本观察符合切口愈合修复过程。4只发现了结石颗粒，1只实验组1，2只实验组2，1只对照组。

2.3 膀胱标本病理切片结果

1周时，基质支架边缘区域已有移行上皮细胞和平滑肌细胞长入基质支架，其腔表面约有一半覆盖泌尿上皮，支架的中心区域未见细胞，基质支架与膀胱组织结合处出现红细胞、白细胞和单核细胞浸润。参见图2.1～图2.3。 2周时，支架边缘区域已有大量移行上皮细胞和平滑肌细胞长入，移行上皮开始分层覆盖在基质支架上面，支架中心区域见少量细胞。参见图2.4～图2.6。 3周时，支架边缘分层的移行上皮继续分化，增殖，支架中心区域细胞增多。参见图2.7～图2.9。 1个月时，支架边缘区域基本形成多层移行上皮细胞，与正常的泌尿上皮细胞差异不大，中心区域长满移行上皮细胞，有少量白细胞和淋巴细胞浸润。参见图2.10～图2.12。 2个月时，植入的基质支架已修复成正常的膀胱组织结构，支架边缘区域细胞密度最高，趋向中心减少。参见图2.13～图2.15。 3个月时，膀胱各层组织基本完全再生，基本完成膀胱组织的替代重建。参见图2.16～图2.18。

图2.1 DAM组

图2.2 BAM组

图2.3 对照组

图2.4 DAM组

图2.5 BAM组

图2.6对照组

图2.7 DAM组

图2.8 BAM组

图2.9 对照组

图2.10 DAM组

图2.11 BAM组

图2.12 对照组

图2.13 DAM组

图2.14 BAM组

图2.15 对照组

图2.16 DAM组

图2.17 BAM组

图2.18 对照组

3 讨论

膀胱生物替代的研究可追溯到20世纪早期，Neuhof〔4〕首先在狗身上用游离筋膜作为移植物代替膀胱，进行了膀胱扩大成形术。此后，许多天然生物材料进行了实验，所有这些移植物的应用基于这样一种概念移植物为膀胱组织生长提供支架，具有再生膀胱组织的能力。所应用的材料包括皮肤、游离筋膜、冷冻膀胱、腹膜，大网膜、冷冻人脑膜、心包、胎盘、小肠粘膜下组织(SIS)和脱细胞基质。由于尿液的复杂理化特性，将人工合成材料应用于泌尿道特别困难。理想的膀胱扩大材料应具有生物可降解性，并且在一定的时间内能被宿主自身组织取代吸收，能促进正常泌尿移行上皮细胞和肌肉组织从其移植边缘生长，能改善膀胱储尿和排尿功能，而且材料本身要求制备方法简单、植入手术容易、术后不易感染、不易形成结石、无致癌性，避免发生异物排斥反应。

脱细胞基质成为替代支架材料，最早起源于同种异体血管修补成形术。目前，脱细胞方法的设计思想主要是为了减少异种材料移植的免疫排斥反应。制备过程需要有效地除去脂质膜层和与之相关的抗原和可溶性蛋白，同时保留细胞外基质成分的原始排列结构〔5〕。到目前为止仅有少数脱细胞基质支架用于临床，进一步完善现有支架并开发新支架将有希望成功地完成临床部分或全膀胱替代。Prost等〔1〕使用BAM移植物用于膀胱扩大术，由于材料取材于膀胱组织，与宿主的膀胱机械性能、结构和遗传特点均相似，经处理后又明显降低了抗原性，移植效果相当满意。

本实验中，使用了两种源于猪的脱细胞基质支架—DAM支架和BAM支架。通过动物实验来证明植入的异种支架可以为兔膀胱组织的替代重建提供适合细胞再生、分化、增殖的体内环境和空间结构，不仅可以扩大、修复、重建膀胱组织，并且成功地完成了膀胱功能的替代。通过预先实验设计的不同时间取得的膀胱标本进行病理切片HE染色观察，从中获得了膀胱组织再生、重建的组织学变化过程的信息。在对照组，膀胱组织的再生仅表现为一般的伤口愈合和修复过程。在两实验组之间组织学表现没有明显的差异性，说明DAM和BAM支架具有相同的性能。术后1周时，我们观察到基质支架边缘有上皮细胞长入支架，其腔表面约有一半覆盖泌尿移行上皮，支架中心区域未见细胞，支架与膀胱结合处出现红细胞、白细胞和单核细胞浸润，类似于创伤后的炎症反应，仅有个别区域的平滑肌细胞浸润到基质支架，但无坏死区域，平滑肌细胞杂乱无方向，血管开始生成。这个现象与Sievert等〔6〕报道一致。Sutherland等〔7〕观察到术后24 h内，移植的支架就出现粒细胞浸润。这些细胞可以清除细胞碎片，吞噬细菌，它们进入移植边缘吻合区域的过程与正常伤口愈合过程相一致。组织中巨噬细胞扩增，分泌生长因子，刺激纤维母细胞和平滑肌细胞增殖。伴随粒细胞浸润，泌尿上皮细胞也显著增殖，促进血管生成。同时，Deboer等〔8〕在鼠膀胱移植中，观察到术后4 h之内开始出现上皮去分化，去分化过程和单核炎症细胞浸润同时发生。24 h形成附着的单层细胞，在3～5 d出现上皮分层。Wefer等〔9〕还报道，在2～3 d伴随着成纤维细胞出现，支架中就出现大量的红细胞和炎症细胞，同期还出现中心体，表明支架与宿主膀胱组织的开始融合，新生的细胞进入支架。术后2周时，我们观察到的支架边缘区域已有大量移行上皮和平滑肌细胞长入，移行上皮细胞分层覆盖在基质支架上面，支架中心区域仅见少量细胞。我们观察到3周时管腔表面排列多层泌尿上皮细胞，基质支架再生的平滑肌仍缺乏组织化。直到1个月时，基质支架边缘的泌尿上皮继续分化增殖，基本形成多层移行细胞结构，覆盖在基质支架上面，与正常泌尿上皮细胞镜下观察差异不大，仅有少量白细胞和淋巴细胞浸润，支架中心区域长满移行上皮细胞，开始分层。在支架边缘区域细胞密度最高，趋向中心逐渐减少。平滑肌细胞开始组织起来，成组排列，肌纤维稳定，血管数量增加、增粗，血管壁逐渐分布平衡。Elbahnasy等〔10〕认为，BAM与宿主膀胱组织的结合连接再生有两种途经，一种从支架边缘细胞开始，一种从支架中心的细胞开始。术后2～3个月时，我们的结果显示膀胱内腔泌尿上皮完全分化、膀胱各层组织再生逐渐完成，再生的平滑肌立体排列重建，血管稳定，血管数减少，但内径增大，有膀胱平滑肌的立体重建，基本完成膀胱组织的替代重建，膀胱功能基本恢复。

通过我们的组织学检查表明，移植物中心区域缺乏很好的成熟泌尿上皮，形成的平滑肌纤维束比邻近宿主组织的平滑肌纤维束要稀疏。这个发现与Li等研究〔11〕基本一致，表明新生平滑肌的形成和表现不同于宿主平滑肌，原因在于是随机排列的，内外层没有明显的进行过排列组织过程。在正常逼尿肌组织中，平滑肌层沿着膀胱壁浆膜面很好的排列组织。造成这些差异可能与泌尿上皮有限的覆盖范围有关，说明了基质—上皮相互作用影响对正常膀胱组织的形成是必需的〔12〕。

成功的膀胱替代扩大术，重建必须限定在膀胱壁组织的各种成分在三维空间生长增殖和形成组织化。这就会引起自身组织的生物和机械功能变化。因此，支架必须要求提供最佳的结构，满足体内细胞生长的需要，产生适当的细胞调控功能，并且要求有利于细胞附着，有利于肽和生长因子等生物反应因子的分布传递〔13〕。Wu等〔14〕在大鼠体内进行了同种异体和异种(仓鼠、兔、狗和猪)的脱细胞材料的膀胱扩大成形术，结果显示越接近宿主膀胱壁结构移植效果越好。

实验动物死亡原因进行分析，感染致死是主要原因，因此感染问题是一个决定替代材料优劣的重要因素。例如，Gleeson等〔15〕就定义了理想的泌尿器官的替代材料应该具有良好的生物相容性和机械稳定性，能够抵御泌尿腔外感染和耐受腔内尿液的感染。另一个致死原因是手术并发症，如膀胱破裂漏尿，术后出血等。另外，基质支架与膀胱组织的缝合方式也是需要探讨的问题，本研究使用了间断缝合方式，因为基质支架面积较小，四周与受体膀胱壁吻合后，术后不易脱落，不易漏尿，比较可靠，不足之处在于造成线结较多，以后形成较多瘢痕组织，也易成为结石核心。如果使用连续缝合方式，我们考虑到虽然手术时间短，线结少，对膀胱影响较小，瘢痕组织较少，但肠线断开、脱落的可能性增加，造成严重的并发症。我们解剖兔子的膀胱标本时，观察到有7只兔子不同程度的出现结石颗粒，虽然近期不影响到排尿，但长期会破坏支架，造成尿路梗阻、感染，影响到肾功能。Deboer等〔8〕认为结石形成后，主要在尿液中漂浮，很少粘附到支架表面或与支架结合，在脱细胞基质支架制备的开始前刮去了粘膜层，当支架与尿液接触后会释放一些纤维成为结石形成的基本核心。此外，即使没有感染，基质支架粗糙表面在泌尿上皮覆盖前也有利于结石形成。因此，制备脱细胞基质支架时，避免形成结石也是我们今后要进一步完善的内容。

4 结论

虽然本实验的样本数量有限，检测的指标较少，但通过移植手术，术后实验观察，显示出脱细胞基质的生物替代效果是值得肯定的。本实验证明猪DAM和猪BAM支架都可作为异种支架进行植入膀胱修复缺损，进行膀胱扩大成形，再生膀胱组织，重建有功能的膀胱，可成为膀胱组织再生替代的支架。猪DAM支架来源广泛，费用低廉，制备方法简单，脱细胞效果确实，可以作为一种广泛使用的生物替代材料，具有广阔的应用前景。