肉桂抑菌活性部位提取工艺优化及HPLC定量研究

翁宗昱，李紫晗，孙 琴，王元清

(中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004)

肉桂(CinnamomumcassiaPreesl)原名菌桂、牡桂，系樟科樟属，是重要的药用和食用植物，国产肉桂为樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPreesl)的干燥树皮[1]，主要分布于广西、广东等地，广西的产量占全国的50%。肉桂中主要含有挥发油、黄酮、黄烷醇、萜类、木质素、多酚、香豆素、皂苷、多糖等多种类型的化合物[2]。挥发油为肉桂的主要活性部位，其中主要有桂皮醛、桂皮醇、甲氧基桂皮醛、α-蒎烯、α-荜澄茄油萜等[2-3]，现代药理研究表明肉桂具有减弱肠胃刺激、强心、改善微循环、抗炎等多种生理活性[4]。现代药理研究亦表明肉桂挥发油中主要成分为桂皮醛，具有解热、镇痛、抗炎、降糖、抗菌、抗肿瘤、抗血小板聚集、抗心肌缺血和抗凝血等多种药理作用[5-8]。现有研究有对肉桂精油提取方法进行报道[9-10]，但是肉桂采用水蒸气蒸馏法提取时，通常只对精油进行研究，没有对蒸馏时的芳香水液进行分析。本研究对肉桂中抗菌活性部位进行均匀设计提取工艺优化及主要成分定量分析，以期为肉桂在食品药品中的开发应用提供依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器

202-OA型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；SPX-250-GB型恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；G154DW型立式自动压力蒸汽灭菌器(致微(厦门)仪器有限公司)；YP1002N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；BIO-KONT型比浊管(康泰生物)；1-Hole Punch打孔机(上海坚明办公用品有限公司)；TS-111B型摇床(上海捷呈实验仪器有限公司)；Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

1.2 试药

肉桂(批号：15120717，执行标准：《中国药典》2015版，湖南振兴中药饮片实业有限公司)；牛肉膏(北京奥博星生物技术有限责任公司)；蛋白胨(上海禽类蛋品公司禽蛋二厂)；NaCl(西陇化工股份有限公司)；无菌水(自制)；肉桂酸对照品(南昌贝塔生物科技有限公司)；桂皮醛(南昌贝塔生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 肉桂抑菌活性部位筛选

2.1.1 肉桂提取 将100 g肉桂利用水蒸气蒸馏法提取出肉桂挥发油并收集蒸馏后的芳香水液，将收集好的芳香水液浓缩后定容至100 mL，制得浓度为1 g/mL的滤液，冷藏备用。

2.1.2 抑菌活性筛选 采用滤纸片法测定抑菌活性。移取7 μL的肉桂精油或肉桂滤液分别滴加至两片直径为6 mm 的灭菌滤纸片上，使其充分吸附。另外移取7 μL生理盐水滴加至另一片直径6 mm的滤纸片上，作为阴性对照。将上述3片滤纸片均匀放置于含有金黄色葡萄球菌试验菌种的平板上，置恒温培养箱(37 ℃)中培养24 h后，观察有无抑菌圈筛选肉桂抑菌活性部位。

2.2 提取工艺

利用水蒸气蒸馏法提取出肉桂精油，分别对浸泡时间、加水量以及蒸馏时间进行考察，在单因素试验的基础上进行均匀设计，获取肉桂精油的最佳提取工艺参数。

2.3 精油中主要成分含量测定

2.3.1 对照品溶液配制 精密称取肉桂酸与桂皮醛对照品适量，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，获得含21 μg/mL的肉桂酸与222 μg/mL的桂皮醛混合对照品溶液。

2.3.2 肉桂精油样品制备 各取100 μL肉桂精油加900 μL甲醇于EP管中，混匀，再取50 μL加1 950 μL甲醇置于5 mL EP管中，混匀，过滤，即得肉桂精油的液相色谱样品。

2.3.3 色谱条件 安捷伦色谱柱C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速0.9 mL/min，λ=254 nm，进样量：10 μL，乙腈：0.1%磷酸水为流动相，时间(min)：0-15-27-35-38-40，乙腈(%)：28-28-35-85-85-28。

2.3.4 样品含量测定 取样品与混合对照品在上述色谱条件下进样测定，采用外标一点法计算精油中肉桂酸与桂皮醛的含量。

3 结果

3.1 抑菌活性部位筛选

采用滤纸片研究肉桂精油和肉桂水液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性图，抑菌实验结果如图1。由图1可知，肉桂经水蒸气蒸馏法获得的肉桂精油有明显的抑菌圈，而蒸馏时的芳香水提液没有抑菌圈，表明肉桂精油对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，而芳香水液无抑菌作用，从而筛选出肉桂抑菌活性部位为精油。

图1 肉桂精油(A)、肉桂芳香水液(B)对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

3.2 单因素考察结果

选择影响精油提取率的几个主要因素：浸泡时间、加水量、提取时间进行单因素试验，试验结果见图2，为均匀设计试验提供基础。

浸泡时间的影响：每份100 g剪碎的肉桂均加水600 mL，不同的浸泡时间(0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h)，提取时间均为6 h，考察不同浸泡时间的精油提取量。由图2可知，浸泡时间为0.5 h时，肉桂精油的提取量最高；随着浸泡时间的延长，肉桂精油提取量变化不明显。可能在0.5 h内，溶液已经充分渗透进肉桂粗粉组织中，使组织中达到饱和。

加水量的影响：每份100 g剪碎的肉桂均浸泡0.5 h，提取时间为6 h，考察加水量为600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1 000 mL时的精油提取量。由图2可知，加水量为700 mL时，挥发油提取量最多，随着加水量的增加，肉桂精油提取量变化不大；加水量较少时，提取量较低。加水量少时，产生的水蒸汽较少，从而随水蒸汽蒸馏出来的油量也少；但加水量太多时，可能是因为芳香水溶液中的油较多，从而使收集到的精油量减弱。

提取时间的影响：每份100 g剪碎的肉桂均浸泡0.5 h，加水700 mL，考察蒸馏时间为4 h、5 h、6 h、7 h、8 h的精油提取量。由图2可知，提取时间在4～7 h时，随着提取时间的增加而提取量增加，7 h时提取量较高；随着时间的进一步延长，略有减少，可能时间太长导致精油挥发损失而减少。

图2 各因素对肉桂精油提取量的影响

3.3 均匀设计

3.3.1 均匀设计试验 在单因素试验之后，设计均匀设计试验来优化工艺。根据单因素试验结果设计均匀设计试验水平。本实验均匀设计采用3因素5水平：浸泡时间分别为0 min、20 min、40 min、60 min、80 min；蒸馏时间分别为4 h、5 h、6 h、7 h、8 h；加水量分别为6倍量(600 mL)、7倍量(700 mL)、8倍量(800 mL)、9倍量(900 mL)、10倍量(1 000 mL)。因素水平设计见表1。按均匀设计表进行试验，分别收集精油，量取体积，结果见表2。

表1 U5*(53)均匀设计因素水平

表2 均匀设计试验结果

表3 回归模型方差分析结果

表4 回归模型系数及检验结果

3.3.2 验证实验 取剪碎的肉桂3份各100 g，均按优选出来的肉桂精油最佳水蒸汽蒸馏提取工艺提取3次，即浸泡20 min，加水量600 mL，提取时间8 h进行水蒸气蒸馏提取，收集精油量，结果见表5。3次验证试验的平均值为1.72 mL，与预测结果接近。所以经均匀设计优选，肉桂抑菌活性部位精油的水蒸气蒸馏提取工艺为100 g粗粉浸泡20 min，加水量为 600 mL(6倍量)，提取时间为8 h。

表5 验证试验结果

3.4 肉桂精油HPLC分析结果

3.4.1 系统适应性考察结果 采用“2.3.3”项下色谱条件进行进样，对照品及样品的色谱见图3，可见在上述色谱条件下，样品和对照品的色谱分离度较好，无干扰。

3.4.2 肉桂精油的定量分析结果 采用“2.3.3”项下色谱条件进行进样，样品中的各成分含量测定结果见表4。由表4可知，肉桂精油中桂皮醛含量高达629.38 mg/g，超过50%；肉桂酸含量为18.76 mg/g。

表6 肉桂精油中肉桂酸与桂皮醛含量结果

4 讨论

抑菌活性筛选研究中，虽有文献[10]报道肉桂精油的抑菌活性，但没有研究比较肉桂水蒸气蒸馏时精油与芳香水液的活性。该研究通过抑菌实验对肉桂水蒸气蒸馏的提取部位进行抑菌活性筛选，研究发现，主要是精油部位具有抑菌活性，可能与肉桂的主要活性成分桂皮醛有关。文献[2]报道，桂皮醛具有挥发性，也是肉桂精油中的主要活性成分。在水蒸气蒸馏过程中，主要活性成分集中于精油中，从而芳香水液没有体现出抑菌活性。

在提取工艺研究中，经单因素试验后再采用均匀设计法对肉桂抑菌活性部位精油进行蒸馏优选，获得其最佳蒸馏提取工艺条件为100 g，肉桂浸泡20 min，加水量为 6倍量(600 mL)，提取时间为8 h。优选出来的工艺经反复验证可行，可为肉桂精油的蒸馏提取与产品开发提供理论依据。

1-肉桂酸；2-桂皮醛

肉桂精油主要成分分析中，桂皮醛含量高达629.38 mg/g，在精油中超过了50%，充分说明桂皮醛是肉桂精油的主要成分；本研究中的桂皮醛含量与文献[10]有一定差异，可能与肉桂的产地、采收、加工及生产时间有一定关系。