高效液相色谱法测定中风回语颗粒中大黄酚的含量

张 君，霍志鹏，史嘉雯，张依倩，王 玉，4，何 毅*

(1.天津中医药大学，天津 301617；2.天士力控股集团有限公司研究院 现代中药开发中心，天津 300410；3.天士力医药集团股份有限公司 创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410；4.天津大学 药物科学与技术学院，天津 300072)

中风回语颗粒是用于治疗缺血性脑中风引起的痰瘀阻络证的中药复方制剂，源自国医大师任继学教授多年临床经验总结而成，该方由石菖蒲、酒大黄、胆南星、冰片、黄连、远志、川芎、郁金、土鳖虫九味中药组成[1]，目前已获得临床批件。中医药治疗缺血性脑中风的原则是活血化瘀、通经活络[2]。大黄是我国常用中药之一，具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效[3]。大黄经酒炙后结合型蒽醌含量降低，缓和了生大黄的苦寒之性，使泻下作用缓和，减轻了腹痛等副作用，又增加了活血化瘀的功效[4]。蒽醌类成分为酒大黄的主要活性成分，现代药理研究表明，该类成分可以通过抗氧化、抗血栓、减轻脑水肿、抑制神经细胞凋亡、抗炎、改善微循环等作用，有效减轻脑缺血缺氧导致的神经损伤[5-9]。大黄酚为蒽醌类成分之一，具有减少炎症因子、抑制氧化应激等功能，促进损伤神经细胞的修复，发挥脑神经保护作用[9-10]，有文献[11-15]报道显示，大黄酚在酒大黄中含量较高，含量范围约0.19%～1.85%。大黄酚的含量对中风回语颗粒的质量控制和临床用药具有一定的指导意义。中风回语颗粒制备工艺包括醇提和水提两个工艺，现有质量标准中已有醇提工艺中盐酸小檗碱作为含量测定的指标项[1]，增加水提工艺中大黄酚含量指标能更好地控制药品质量。因此，本课题建立了中风回语颗粒中大黄酚的含量测定方法，现报告如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260液相色谱仪(安捷伦公司，包括自动进样器、柱温箱、二元梯度泵、DAD二极管阵列检测器)；METTER TOLEDO XS205DU电子分析天平(梅特勒公司)；KQ-500DV型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

中风回语颗粒(由天士力控股集团有限公司研究院实验室自制，批号：20190301、20190501)；大黄酚对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号：110796-201621)；甲醇、磷酸为色谱纯；Milli-Q超纯水(美国Millipore公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱采用Dimonsil C18色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱温为30 ℃，流动相为0.1%磷酸水-甲醇(20∶80)，流速为1.0 mL·min-1，检测波长254 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成含大黄酚24.82 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取中风回语颗粒，研细，精密称定约1.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液20 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷20 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[3，16-18]。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取除酒大黄外的其他八味中药，以处方量按工艺制法制成酒大黄阴性对照样品，按照“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.3 专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样、测定，阴性样品溶液在大黄酚对照品相应位置处未见色谱峰，表明本方法测定中风回语颗粒中大黄酚的含量，专属性良好，见图1。

注：A.大黄酚对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.大黄酚峰

2.4 精密度试验

取对照品溶液按“2.1”项下色谱条件分别进样6次，每次进样10 μL，测定峰面积，结果大黄酚RSD为0.28%，表明仪器精密度良好。

2.5 线性范围

精密称取大黄酚对照品适量，加甲醇配成浓度为10.05、20.11、40.22、80.45、160.90 μg·mL-1的对照品标准溶液，取上述对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样，记录峰面积，以对照品质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，得大黄酚的回归方程为：Y=53 681.0X+2 802.9，r=1.000 0，表明大黄酚进样浓度在10.05～160.90 μg·mL-1范围内与峰面积具有良好的线性关系，见图2。

图2 大黄酚的标准曲线

2.6 稳定性试验

取同一份供试品溶液(批号：20190301)，在0、2、4、8、16和24 h分别按“2.1”项下色谱条件进样10 μL，结果大黄酚峰面积RSD为0.37%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取同一供试品(批号：20190301)按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样10 μL，记录峰面积。结果大黄酚含量平均值为0.269 8 mg·g-1，RSD为2.21%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

取已知含量的样品(批号：20190301)，研细，取6份，每份约0.6 g，精密称定，分别精密加入大黄酚(6.71 μg·mL-1)对照品溶液25 mL，按“2.2.2”项下方法制备加标溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样10 μL测定，计算回收率。结果得大黄酚平均回收率(n=6)为98.16%，RSD为1.17%，结果见表1。

表1 加样回收试验结果 (n=6)

2.9 样品测定

分别称取不同批号的中风回语颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样10 μL，记录峰面积，以外标法计算含量，结果见表2。

表2 中风回语颗粒中大黄酚的含量测定结果

3 讨论

3.1 指标性成分的选择

本课题尝试了同时测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5个指标性成分方法的开发，处方中含有九味中药，基质复杂，试验过程中发现芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和基质中其他成分不能达到基线分离，大黄素甲醚峰面积较低，积分波动大，大黄酚分离度良好，适合用于含量测定，且大黄酚在酒大黄中含量较高[11-14]，有明确的与中风后恢复相关的抗炎、减轻氧化应激损伤，保护神经的作用[9-10]，测定制剂中大黄酚的含量，对中风回语颗粒的质量控制有较大意义，因此选择大黄酚进行含量测定。

3.2 检测波长的选择

经检索文献[16-18]及参考《中国药典》[3]中大黄相关的含量测定方法，均选择254 nm作为检测波长。本课题在该波长下进行了样品分析，大黄酚峰型好，基线平稳，周围无杂质峰，故选择254 nm作为检测波长。

3.3 提取方式的选择

本课题比较了甲醇溶解提取和盐酸水解后萃取两种提取方式，发现甲醇溶解提取的大黄酚含量为水解后萃取的4.84%，表明大黄酚大部分以结合蒽醌形式存在于颗粒中，水解后萃取方式(甲醇超声溶解-加酸水解-加热回流-液液萃取)更适合检测中风回语颗粒中大黄酚的含量。

3.4 流动相的选择

本课题对0.1%磷酸水-乙腈(15∶85)、0.1%磷酸水-甲醇(15∶85)、0.1%磷酸水-甲醇(20∶80)流动相系统进行了分析比较，发现使用前两种流动相系统时，大黄酚出峰时间靠前，周围基线不平稳，0.1%磷酸水-甲醇(20∶80)为流动相时，色谱峰峰型较好，基线平稳，峰分离度较好，且分析时间适宜，故确定流动相为0.1%磷酸水-甲醇(20∶80)。

4 结论

本课题建立了中风回语颗粒中大黄酚的含量测定方法，方法学验证结果表明该方法准确度高、专属性强、重复性好，符合《中国药典》[19]通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则的要求，可用于中风回语颗粒质量的控制和评价。同时，该方法对含有大黄药材的其他中成药质量研究具有一定参考意义。