特香型年份白酒挥发性成分气相指纹图谱实验方法学的研究

杨 莹，吴生文，林 培，徐柏田，熊秋萍

（四特酒有限责任公司，江西樟树 331200）

年份酒作为一种高品质产品的代表，在白酒行业内已经被推崇多年，具有较高年份的产品也被消费者所追崇。近年来，由于缺乏规范的标准约束，没有可以参照的年份酒产品执行标准，年份酒产品市场呈现较为混乱的现状。只有制定出相关标准，监管部门才能有法可依。然而这急需行业协会同白酒骨干企业一起，对年份酒进行标准化管理。指纹图谱对样品进行定量分析是对复杂物系进行质量评价的一种重要方法，可以全面反映成分较复杂的样品，更有效地体现产品的整体性[1-2]。指纹图谱就像人的指纹一样具有专一性和代表性，将处理后的实验样品用光谱或者色谱的分析手段，得到能指示实验样品唯一性的谱图。迄今为止就有很多方法可以表征指纹图谱，如高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、气相色谱（gas chromatography，GC）法、红外光谱（infrared spectrometry，IR）法、核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）法等分析方法[3-4]。

气相色谱法的分离原理是使混合样品中各组分在两相间进行分配，其中一相为固定相，另一相则推动混合物流过此固定相[5]，在同一推动力作用下，不同的组分在固定相中的停留的时间不同，从而按照先后顺序从色谱柱中流出[6-7]。气相色谱法具有选择性强、效能较高、灵敏度高、分析速度快、应用广泛、操作简便，已成为一种极重要的现代分析工具[8-9]。气相色谱在白酒分析中已得到了极其广泛的应用[10]。

目前，国内大型白酒企业基本都已开始研究和应用指纹图谱技术。例如：河北衡水老白干利用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用图谱建立老白干酒风味物质指纹图谱[11]；四川理工学院进行浓香型白酒基酒指纹图谱的模式识别研究[12]；司法部司法鉴定科学技术研究所等研究GC-MS指纹图谱并应用在贵州茅台酒的鉴别中[13]等。本实验建立特香型四特年份白酒的气相色谱检测方法，并对气相指纹图谱的实验方法学进行考察，判断检测方法精密度、实验方法稳定性，并分析能否满足气相色谱指纹图谱分析的技术要求，为后期制定特香型年份酒标准提供实验方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

二十年成品白酒（45%vol）：四特酒有限责任公司；叔戊醇（纯度≥99.6%）、乙酸正戊酯（纯度≥99.4%）、乙醇（纯度≥99.9%）、乙醛（纯度≥99.8%）、甲酸乙酯（纯度≥99.7%）、乙酸乙酯（纯度100%）、乙缩醛（纯度≥99.4%）、甲醇（纯度≥99.4%）、异戊醛（纯度≥98.2%）、仲丁醇（纯度≥99.8%）、丁酸乙酯（纯度≥99.8%）、正丙醇（纯度≥99.8%）、异丁醇（纯度≥99.8%）、戊酸乙酯（纯度≥99.8%）、正丁醇（纯度≥99.9%）、2-甲基-1-丁醇（纯度≥99.6%）、异戊醇（纯度≥99.8%）、己酸乙酯（纯度≥99.8%）、正戊醇（纯度≥99.8%）、醋嗡（纯度≥99.3%）、庚酸乙酯（纯度≥99.0%）、乳酸乙酯（纯度≥99.8%）、正己醇（纯度≥99.9%）、辛酸乙酯（纯度≥99.6%）、糠醛（纯度≥98.8%）、丙酸（纯度≥99.8%）、2,3-丁二醇（左）（纯度≥99.8%）、2,3-丁二醇（内）（纯度≥99.8%）、异丁酸（纯度≥99.8%）、丁酸（纯度≥99.7%）、异戊酸（纯度≥99.0%）、戊酸（纯度≥99.1%）、己酸（纯度≥99.8%）、棕榈酸乙酯（纯度≥99.8%）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

8860型气相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；DB-624UI毛细管色谱（30 m×0.53 mm×3.00 μm）：美国安捷伦科技有限公司；VORTEX-5KYLIN-BELL旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 内标溶液制备

参照国家标准GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[14]并略有改动。准确称量2 mL乙酸正戊酯与2 mL叔戊醇的质量，装于100 mL的容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇定容至刻度，配制2%（V/V）的内标溶液，并分别计算乙酸正戊酯与叔戊醇的含量，得出混合内标中叔戊醇含量为15.196 7 g/L，乙酸正戊酯含量为15.196 7 g/L。

1.3.2 白酒溶液制备

移液枪吸取1.3.1中配制的叔戊醇与乙酸正戊酯混合内标100 μL于100 mL白酒样品中，漩涡振荡混匀[15]。

1.3.3 气相色谱条件

载气（氮气（N2））流速：1.5 mL/min；氢气（H2）流速：30 mL/min；尾吹流速：40 mL/min；空气流速：400 mL/min；检测器：氢火焰离子化检测器；气化温度：250 ℃；进样量1 μL。

1.3.4 方法学考察

（1）精密度试验

取二十年四特酒样品，按1.3.2方法制备白酒样品溶液，按1.3.3的实验条件下，重复进样5次。参照由国家药品监督管理局发布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》[16]进行实验，采用标准品的相对保留时间来标定指纹峰。在四特酒二十年样品的指纹图谱中，内标叔戊醇用来标定醇类物质[17]，其相对保留时间以及相对共有峰面积均设为1，以各共有醇类物质指纹峰的保留时间、共有峰面积分别与叔戊醇保留时间、共有峰面积的比值作为各峰的相对保留时间和相对峰面积；内标乙酸正戊酯用来标定除醇类以外的物质[18]，相对保留时间为与相对共有峰面积设为1，以各共有指纹峰的保留时间、共有峰面积分别与乙酸正戊酯保留时间、共有峰面积的比值作为各峰的相对保留时间和相对峰面积。

（2）重现性试验

取叔戊醇与乙酸正戊酯试剂按1.3.1方法制备5份内标，按1.3.3实验条件测定内标保留时间与峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，判断内标溶液配制方法的重现性。分别取同一个二十年四特酒酒样5次，分别按照1.3.2方法配制酒样溶液，按1.3.3实验条件测定，并对共有峰相对保留时间与相对峰面积进行统计。

（3）稳定性试验

取一个二十年四特酒酒样，按1.3.2方法制备酒样溶液，按1.3.3实验条件下分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h下进样，实验间隔期将白酒样品用封口膜封口，并放置于冰箱内保存，对保留时间及相对峰面积的数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 二十年特香白酒挥发性成分分析气相色谱图

取四特酒二十年酒样按1.3.2方法制备酒样，根据前期摸索实验条件：载气（氮气）流速为1.5 mL/min；分流比30∶1；程序升温：初始温度40 ℃，保留4 min，以3 ℃/min的速率升温到80 ℃，保留3 min，第二阶段以8 ℃/min的速率升温到200 ℃，保留8 min，运行40 min的气相色谱图见图1。

图1 特香型年份酒中挥发性成分的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of volatile components in Te-flavor aged Baijiu

由图1可以看出，主要色谱峰在0～40 min之间比较均匀分布、色谱峰的峰型较好、混合物中各组分能分离。说明在此条件下，分离效果较佳，预实验摸索的检测条件适合用于研究仪器精密度、方法重现性以及样品稳定性试验。

2.2 精密度试验

内标叔戊醇用来标定醇类物质，内标乙酸正戊酯用来标定除醇类以外的物质，以各共有指纹峰的保留时间与对应的内标峰保留时间的比值作为各峰的相对保留时间，结果见表1。以各共有峰面积与对应的内标峰面积的比值作为各峰的相对峰面积，结果见表2。

表1 以相对保留时间为评价指标的方法精密度试验结果Table 1 Results of method precision tests using relative retention time as evaluation index

表2 以相对峰面积为评价指标的方法精密度试验结果Table 2 Results of method precision tests using relative peak area as evaluation index

续表

由表1、表2可以看出，在方法精密度试验中，共有峰的相对保留时间RSD均＜0.03%，相对峰面积RSD均＜3.0%。结果表明，该方法的精密度较好。

2.3 重现性试验

取叔戊醇与乙酸正戊酯试剂按1.3.1方法制备5份内标，并按1.3.3实验条件测定内标叔戊醇、乙酸正戊酯保留时间分别为11.142 min、17.803 min，其RSD均为0.01%；峰面积平均值分别为24.071、21.718，其RSD分别为1.21%、2.41%，表明内标溶液配制方法的重现性良好。在此基础上进行样品方法重现性试验，结果分别见表3、表4。

表3 以相对保留时间为评价指标的方法重现性试验结果Table 3 Results of method reproducibility tests using relative retention time as evaluation index

续表

表4 以相对峰面积为评价指标的方法重现性试验结果Table 4 Results of method reproducibility tests using relative peak area as evaluation index

续表

由表3、表4可知，气相图谱中的醇、醛、酸、酯类峰相对保留时间均＜0.03%，相对峰面积RSD均＜3.0%。结果表明，该方法灵敏度高、准确重现性较好[19-20]。

2.4 稳定性试验

对样品间隔进样，分析样品的稳定性，样品稳定性试验结果分别见表5、表6。

表5 以相对保留时间为评价指标的样品稳定性试验结果Table 5 Results of sample stability tests using relative retention time as evaluation index

表6 以相对峰面积为评价指标的样品稳定性试验结果Table 6 Results sample stability tests using relative peak area as evaluation index

由表5、表6可以看出，各色谱峰相对保留时间RSD均＜0.03%，相对峰面积RSD均＜3.0%。结果表明，该方法稳定性良好，检测结果在24 h内较稳定[21-22]。

3 结论

以氮气（N2）为载气，流速为1.5 mL/min；分流比30∶1；程序升温：初始温度40 ℃，保留4 min，以3 ℃/min的速率升温到80 ℃，保留3 min，第二阶段以8 ℃/min的速率升温到200 ℃，保留8 min的参数条件进行实验，分离效果较佳，预试验建立的气相特香型年份白酒指纹图谱的方法与条件可行。在上述实验条件下对实验方法进行了考察，根据相对保留时间与相对峰面积RSD，判断方法的可行性。其精密度、重现性、稳定性试验中各色谱峰的相对保留时间RSD均＜0.03%，相对峰面积RSD均＜3.0%。结果表明，气相色谱检测精密度、重现性良好、稳定可行，能够满足特香型四特年份酒指纹图谱的技术要求。