ACACB基因DNA甲基化/过表达的肝癌细胞株MHCC97H增殖侵袭迁移能力变化观察

伍柳玉，胡艳玲，刘顺，秦小玲，梁秋丽，刘美良，杨钰，曾小云

1广西医科大学公共卫生学院，南宁530199；2广西医科大学生命科学研究院；3广西中医药大学公共与管理学院

研究［1-2］显示，乙酰辅酶A羧化酶（ACACB）作为参与体内氧化应激、脂质代谢等过程的关键基因，被发现在癌症中也发挥重要作用。已有研究［3-4］显示，ACACB基因在肝细胞癌（HCC）组织中存在表达下调现象，可能与肝癌的发生发展有关。DNA甲基化作为表观遗传的一种，被认为是肿瘤发生的重要危险因素。研究［5-6］表明，在各肿瘤细胞中普遍存在DNA的异常甲基化，其存在导致相关基因表达的沉默或上调，造成包括DNA修复、细胞周期调节、促进细胞凋亡或控制关键的肿瘤相关信号网络通路的改变，影响肿瘤的诊断、发展、分型以及治疗敏感性［7-8］。本课题组前期通过TCGA数据库对ACACB基因进行生物信息学整合时发现，ACACB在肝癌组织中表达下调，且与其甲基化位点cg06131338的甲基化水平呈负相关，据此推测ACACB基因可能具有影响肝癌发生发展的作用，但进一步的研究论证尚未在肝癌细胞株中开展。2018年10月—2020年1月，本研究观察了抑制ACACB基因DNA甲基化/感染ACACB基因过表达慢病毒dCAS9-VP64的肝癌细胞株MHCC97H增殖侵袭迁移能力变化情况，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂 肝癌细胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及正常肝细胞株LO2均购买于上海中国科学院细胞库，使用含有10%胎牛血清的培养基，于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行细胞培养，待细胞密度达80%～90%时进行传代及细胞提取。胎牛血清、DMEM/MEM/RPMI1640细胞培养基购自美国Gibco公司，胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS缓冲液、二甲基亚砜(DMSO）购自北京索莱宝公司，氯仿购自北京天根公司，TRIzol购自美国Life公司，Thermo Scientific Gene-JET基因组DNA纯化试剂盒购自Thermo公司，DNA maker购自北京天根公司，CCK8试剂购自日本同仁化学公司，反转录试剂盒、PCR试剂盒购自Ta-KaRa公司，DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂脱氧胞苷（5-Aza-CdR）购自美国Sigma公司，引物由生工生物公司合成，ACACB过表达慢病毒dCAS9-VP64购自上海吉凯基因公司。

1.2 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2中ACACB mRNA检测 取SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2细胞于培养板中，使用Thermo Scientific GeneJET基因组DNA纯化试剂盒提取总DNA，使用TRIzol试剂裂解细胞并提取RNA，使用Bio-teck酶标仪进行浓度及纯度的检测。使用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ说明进行PCR扩增。ACACB上游引物为5′-GGGAAAGCAAAATGAATGGAAG-3′，下游引物为5′-GAGAAGAGGTGGGCAGAGGA-3′；内参GAPDH上游引物为5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物为5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR扩增体系共20μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ10μL，cDNA模板2μL，ROX Reference Dye 0.4μL，上下游引物各0.8μL，dH2O 6μL。PCR反应条件：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，40个循环，以2-ΔΔCt表示细胞中ACACB mRNA的相对表达量。

1.3 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L、LO2细胞中ACACB基因cg06131338位点甲基化率测算及受试肝癌细胞株筛选 采用焦磷酸测序实验，取SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2细胞于培养板中，使用Thermo Scientific Gene-JET基因组DNA纯化试剂盒提取总DNA，使用Bioteck酶标仪进行浓度及纯度的检测。重亚硫酸氢盐的转化按照EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit 59124试剂盒的说明进行，配置的亚硫酸盐转化体系为140μL：DNA溶液40μL，亚硫酸氢盐混合液85μL，DNA Protect Buffer 15μL，RNase-free water补充至总体积140μL，热循环条件：95℃5 min，60℃25 min，95℃5 min，60℃85 min，95℃5 min，60℃175 min。ACACB基因cg06131338位点的上游引物为F-TGGAGTTATATATAGGGTGGATTTTAGAAG，下 游 引物为R-CAATCCCCATAAACTCTATACTATTTCTTC。甲基化PCR反应 体系：dH2O 34.8μL，5×buffer 10μL，dNTP 1μL，上下游引物各1μL，Template 2μL，Taq 0.2μL。反应条件：95℃3 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，72℃7 min，40个循环。甲基化的检测通过Pyrosequencing检测仪进行，反应结束后使用PyroMark Q96 ID软件自动计算每个CpG位点的甲基化率。

1.4 受试肝癌细胞株ACACB基因DNA甲基化的抑制及分组 选取甲基化率相对较高的肝癌细胞株MHCC97H，调整细胞悬液浓度至3.5×104/mL，按每孔2 mL的体积接种于6孔板中，正常培养16～24 h后分为5-Aza-CdR组、对照组。5-Aza-CdR组每孔加入2 mL浓度为2.5μmol/L的5-Aza-CdR完全培养基，对照组加入含相同剂量DMSO完全培养基，每隔24 h更换一次完全培养基，持续培养96 h后收集细胞，参照“1.3”测算5-Aza-CdR组、对照组细胞中ACACB基因cg06131338位点甲基化率，参照“1.2”检测5-Aza-CdR组、对照组细胞中ACACB mRNA。

1.5 受试肝癌细胞株ACACB基因过表达慢病毒dCAS9-VP64感染及分组 采用SAM双载体慢病毒感染法。选取甲基化率相对较高的肝癌细胞株，取8×104个细胞接种于6孔板中，培养16～24 h后，感染dCAS9-VP64-Puro慢病毒并继续培养12 h，更换为正常培养基，3 d后改用2.5μmol/L嘌呤霉素浓度的完全培养基进行筛选。收集成功感染dCAS9-VP64-Puro慢病毒的细胞分为ACACB过表达组和阴性表达组，按照上述步骤感染dCAS9-VP64慢病毒和阴性对照慢病毒，参照“1.2”检测ACACB过表达组、阴性对照组细胞中ACACB mRNA。

1.6 各组细胞增殖能力观察 取各组细胞以1 000/孔的量接种于96孔板中，每组重复6个平行复孔，培养8 h待细胞贴壁后，将完全培养基与CCK8试剂按9∶1的比例混合，以100μL/孔的混合液加入后，在培养箱中继续孵育72 h，在450 nm波长下使用酶标仪读取每孔的OD值，以OD值表示细胞增殖能力。

1.7 各组细胞侵袭、迁移能力观察 ①各组细胞侵袭能力观察。取各组细胞，以1×105个加入含有基质胶的侵袭小室的上层，小室下层加入650μL的完全培养基，培养箱中继续培养72 h后，使用4%多聚甲醛固定下表面的穿膜细胞，用0.1%的结晶紫染色、干燥，各侵袭小室在显微镜下随机选取6个视野的细胞进行计数，以侵袭细胞数表示细胞增殖能力。②细胞迁移能力观察。取各组细胞，以5×104个加入不含基质胶的迁移小室的上层，小室下层加入650μL的完全培养基，培养箱中继续培养72 h后，使用4%多聚甲醛固定下表面的穿膜细胞，用0.1%的结晶紫染色、干燥，显微镜下随机选取6个视野的细胞进行计数，以迁移细胞数表示细胞迁移能力。

1.8 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料以±s表示，比较用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2中ACACB mRNA相对表达量比较 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB mRNA的相对表达量分别为0.54±0.04、0.48±0.05、0.39±0.03、0.34±0.01，LO2中ACACB mRNA的相对表达量为1.04±0.07，SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB mRNA的相对表达量与LO2相比，P均<0.01。

2.2 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L、LO2细胞中ACACB基因cg06131338位点甲基化率比较及受试肝癌细胞株筛选结果 肝癌细胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB基因cg06131338位点甲基化率分别为54.68%±3.63%、62.43%±3.77%、66.29%±2.29%、62.25%±3.28%，正常肝细胞株LO2中ACACB基因cg06131338位点甲基化率为44.29%±3.69%，肝癌细胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB基因cg06131338位点甲基化率与正常肝细胞株LO2相比，P均<0.01。其中，cg06131338位点甲基化率相对较高的肝癌细胞株为MHCC97H，选取MHCC97H为后续实验受试肝癌细胞株。

2.3 5-Aza-CdR组和对照组细胞中ACACB基因cg06131338位点甲基化率、ACACB mRNA相对表达量比较 5-Aza-CdR组和对照组细胞中ACACB基因cg06131338位点甲基化率分别为45.59%±2.51%、67.55%±3.18%，两组相比，P<0.01。5-Aza-CdR组和对照组细胞中ACACB mRNA相对表达量分别为0.52±0.03、0.39±0.03，两组相比，P<0.01。

2.4 ACACB过表达组、阴性对照组细胞中ACACB mRNA相对表达量比较 ACACB过表达组、阴性对照组细胞中ACACB mRNA的相对表达量分别为5.90±0.65、1.04±0.05，两组相比，P<0.01。

2.5 各组细胞增殖能力比较 5-Aza-CdR组和对照组细胞孵育72 h时的OD值分别为0.42±0.01、0.58±0.01，两组相比，P<0.05。ACACB过表达组和阴性对照组细胞孵育72 h时的OD值分别为0.37±0.04、0.45±0.05，两组相比，P<0.05。

2.6 各组细胞侵袭、迁移能力比较 5-Aza-CdR组和对照组侵袭细胞数分别为（12±4）、（43±3）个，两组相比，P<0.01。ACACB过表达组和阴性对照组侵袭细胞数分别为（17±5）、（47±7）个，两组相比，P<0.01。5-Aza-CdR组和对照组迁移细胞数分别为（21±4）、（63±6）个，两组相比，P<0.01。ACACB过表达组和阴性对照组迁移细胞数分别为（17±6）、（49±14）个，两组相比，P<0.01。

3 讨论

HCC是全球范围内最常见的几大癌症之一。研究［9］显示，HCC是一种复杂的、多步骤的疾病，涉及的过程与基因组的扩增、缺失或突变有关。同时，由于HCC起病隐匿、病死率高［10］，因此寻找高灵敏度与高特异度的肝癌早期诊断分子生物标记物仍是当前研究的重点。

ACACB基因是催化脂肪酸合成代谢第一步反应的限速酶［11］，可能参与多种肿瘤的形成与发展，其表达能对相关癌症的走向产生影响。早期针对视网膜母细胞瘤的研究［12］显示，ACACB基因可能通过参与有关细胞信号通路的调控，如脂质的代谢、氧化应激、细胞周期与细胞凋亡等，从而在视网膜母细胞瘤的进展中发挥重要作用。还有研究［13］发现，ACACB基因与肺癌患者的生存率显著相关，并且在人肺癌样本中表达普遍下调，且通过建立小鼠基因敲除模型，验证了ACACB基因的敲除能显著促进小鼠体内肺肿瘤的发生。本研究通过LO2肝细胞株与4株肝癌细胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97的培养与检测，发现了ACACB基因在肝癌细胞株中表达明显降低，进一步，我们通过在MHCC97H细胞株中过表达ACACB基因后，发现细胞的增殖、侵袭与迁移的能力均下降，故推测ACACB基因在HCC的恶性化进展中可能发挥抑癌基因的作用。相关体内研究［13-14］亦显示ACACB基因在肿瘤抑制中的作用，这与本研究结果具有一致性。

DNA甲基化作为最常见的一种表观遗传方式，对细胞的分化与功能起着至关重要的作用［15］。随着基因组学研究的深入，发现表观遗传学、基因表达、肿瘤发生三者之间密切相关。研究［5-6］表明，当基因组特定序列出现异常的高/低甲基化时，往往能导致相关基因表达的改变，影响肿瘤的发生发展。QI等［16］通过大样本人群验证了MGMT基因的超甲基化与大肠癌中MGMT表达的缺失有关，认为MGMT基因表观遗传失活加快了大肠癌的进程。SIZEMORE等［17］通过建立乳腺癌患者队列研究发现，基因MMP7的表达与其启动子甲基化状态显著相关。不仅如此，由于异常甲基化的发生通常要先于细胞的恶性增生，故而DNA的局部异常甲基化对肿瘤发生风险的预测及早期癌症筛查方面具有重要参考作用［18］。本研究中，通过检测ACACB基因cg06131338位点在LO2肝细胞株与肝癌细胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中的甲基化水平，发现了cg06131338位点在各肝癌细胞株中甲基化率显著增加，且可能与基因表达的抑制有关。为进一步探索，我们利用DNA甲基化可逆的特点，使用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR作用于MHCC97H细胞，发现在cg06131338位点的甲基化水平降低的同时，ACACB的转录水平也相应升高。随后，本研究通过细胞相关功能实验发现，5-Aza-CdR的处理能显著抑制细胞的增殖、侵袭与迁移的能力。本研究结果表明，cg06131338位点的高甲基化可能通过抑制基因ACACB的表达，并由此促进HCC的进展。

综上，在肝癌细胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中，ACACB mRNA表达降低、ACACB基因cg06131338位点甲基化率升高，抑制cg06131338位点的甲基化可升高ACACB mRNA表达水平。抑制cg06131338位点的甲基化或过表达ACACB均可降低MHCC97H细胞增殖、侵袭和迁移能力。ACACB基因可能是HCC中潜在的抑癌基因，ACACB基因及其甲基化位点cg06131338可能是潜在的肝癌早期诊断标记物与治疗靶点。