外源性Klotho对糖尿病肾病小鼠成骨细胞甲状旁腺激素刺激的分化活性调控作用

刘建梅，贾俊亚，闫铁昆，于亚民，韦丽，商文雅，林珊

天津医科大学总医院肾内科，天津300052

糖尿病和骨代谢异常之间存在密切联系［1］。研究［2-3］显示，2型糖尿病患者髋骨和脊椎骨骨折的风险增加。糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，占糖尿病患者的40%，是全球终末期肾病（ESRD）的主要病因之一。糖尿病肾病患者存在明显骨代谢改变，包括骨质减少、骨折和骨质疏松症风险增加［4-5］。Klotho是成纤维细胞生长因子-23（FGF23）的辅助受体，主要表达于肾小管上皮细胞，Klotho和FGF23两者相互作用参与矿物质平衡［6］。最近研究［7-8］发现，Klotho在成骨细胞/骨细胞中也有表达，并在骨组织—甲状旁腺激素（PTH）反应中起重要作用。研究［9-11］显示，在糖尿病肾病状态下，肾组织及循环系统中Klotho表达均有明显减少。以往研究证实PTH可促进成骨细胞分化活性的增加，可使cAMP、p-PKA、p-ERK1/2等细胞内分子表达增加［12］。2014年2月—2016年11月，本研究观察了外源性Klotho对糖尿病肾病小鼠成骨细胞PTH刺激的分化活性的调控作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 小鼠 18周龄KK-Ay糖尿病肾病模型小鼠及C57BL/6J正常小鼠各12只，购自协和医科大学实验动物中心，于SPF实验室常规饲养1周，断尾法测血糖后处死。

1.2 小鼠成骨细胞的培养与鉴定 利用骨片贴壁分离筛选法。处死小鼠后取股骨剪碎，与含有2 mg/mLⅡ型胶原酶和2%青霉素-链霉素的α-MEM消化培养基在37℃水浴中温育4 h，PBS洗涤骨片，并在补充有2%青霉素—链霉素和10%小牛血清（PAA）的α的A清（培养基中培养至90%汇合，即可获得骨髓间充质干细胞（BMMSC），其后在磷酸甘油及地塞米松培养基中诱导分化为成骨细胞。采用免疫组化法分析细胞表达碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）及采用von Kossa染色分析细胞外磷酸钙沉积及骨结节形成等成骨细胞特征性标志物，对成骨细胞进行鉴定。鉴定结果显示，细胞中ALP表达显著增加，von Kossa染色及HE染色显示骨结节形成，证实为成骨细胞。

1.3 细胞分组和PTH（1-34）、Klotho刺激 取第3代培养细胞在无血清培养基中培养，并分为A、B组，A组为KK-Ay小鼠成骨细胞，B组为C57BL/6J小鼠成骨细胞。A组成骨细胞分别加入不同浓度的PTH（1-34）、Klotho，其中A1组加入0μg/mL的PTH（1-34），A2组加入0.05μg/mL的PTH（1-34），A3组加入0.1μg/mL的PTH（1-34），A4组加入0.2μg/mL的PTH（1-34），A5组加入0.1μg/mL的PTH（1-34）和100 ng/mL的Klotho。B组成骨细胞参照A组各亚组给予相同刺激，分别记为B1组、B2组、B3组、B4组、B5组。

1.4 各组细胞中环磷酸腺苷（cAMP）、磷酸化蛋白激酶A（p-PKA）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）1/2检测 观察各组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量，以cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量表示成骨细胞对PTH刺激的反应性。

1.4.1 各组细胞中cAMP检测 采用ELISA法。取各组细胞，裂解、稀释后加入中和缓冲液及乙酰化试剂，震荡并孵育后转移至96孔板，按照ELISA检测试剂盒说明书步骤操作，用酶标仪分析450 nm处吸光度值，并与cAMP标准曲线进行比较，计算细胞中cAMP浓度。

1.4.2 各组细胞中p-PKA、p-ERK1/2检测 采用蛋白印迹法。取各组细胞，加入200μL含PMSF裂解液，于冰上裂解30 min，将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL EP管中，4℃条件下12 000转离心5 min，收集上清液，加4集蛋白上样缓冲液，使上样缓冲液稀释为1白；将蛋白置于蛋白加热器上煮10 min，于-80℃冰箱保存。制备BCA标准品，将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，补足到20μL；加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μL，各孔加入200μL BCA工作液，37℃振荡孵育30 min，冷却至室温；酶标仪测定562 nm处吸光度值，以标准品吸光度值和相应蛋白浓度绘制标准曲线，由此标准曲线计算出待测样品的蛋白质浓度。蛋白变性后上样，每个上样孔加入40μg的蛋白进行电泳，将硝酸纤维素膜和滤纸在转膜缓冲液中浸泡30 min，280 mA恒流电转移2 h。将PVDF膜浸于膜封闭液中室温孵育，2 h后弃去膜封闭液，稀释并加入一抗，4℃轻摇孵育过夜，弃去一抗溶液，TBST溶液室温下摇洗5次，每次1 min。弃去TBST，加入适量稀释的二抗，室温轻摇孵育1 h，TBST溶液室温下摇洗5次，每次1 min，置于Chemi Genus2凝胶成像分析系统中进行曝光和摄像，使用Quantity One Software 4.6.2软件进行条带灰度值测算，计算目的蛋白的相对表达量。目的蛋白的相对表达量=目的条带灰度值/同一样本GAPDH灰度值。

1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

A1组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.1±0.0）nmol/mL、0.2±0.0、0.3±0.1，A2组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.1±0.0）nmol/mL、0.3±0.0、0.2±0.0，A3组细 胞 中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.1±0.0）nmol/mL、0.3±0.0、0.3±0.1，A4组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.1±0.0）nmol/mL、0.3±0.0、0.2±0.0，组间相比，P均>0.05，提示KK-Ay小鼠成骨细胞对PTH（1-34）刺激无反应。

B1组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.2±0.0）nmol/mL、0.3±0.0、0.5±0.1，B2组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.4±0.1）nmol/mL、1.2±0.4、1.9±1.0，B3组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.6±0.1）nmol/mL、2.3±0.8、3.3±1.5，B4组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.8±0.1）nmol/mL、3.6±1.5、5.3±2.8，组间相比，P均<0.05，提示C57BL/6J小鼠成骨细胞对PTH（1-34）的刺激反应性与PTH（1-34）的浓度有关，呈剂量依赖性上升。

A5组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.6±0.1）nmol/mL、4.7±2.2、5.5±1.8，B5组细胞中cAMP浓度、p-PKA相对表达量、p-ERK1/2相对表达量分别为（0.6±0.2）nmol/mL、3.7±1.8、5.6±2.3，两组相比，P均>0.05，说明加入外源性Klotho后，两组小鼠成骨细胞对PTH（1-34）的刺激反应性一致。

3 讨论

糖尿病肾病常导致骨代谢异常，常表现为明显的低动力性骨病，加重慢性肾脏病相关的钙磷代谢紊乱，如何纠正糖尿病肾病状态下成骨细胞活性的下降，是重要的临床课题［13］。最近发现，Klotho在成骨细胞-甲状旁腺激素反应中起重要的调节作用［7-8］，在糖尿病肾病患者，循环系统中Klotho表达明显减少［9-11］。本研究探讨了外源性重组Klotho对体外原代培养KK-Ay小鼠的成骨细胞PTH（1-34）信号通路的影响，发现在外源性重组Klotho作用下，成骨细胞中cAMP、p-PKA及p-ERK1/2水平显著上升，提示Klotho可恢复PTH对糖尿病肾病成骨细胞活性的促进作用，可能有利于纠正低转化骨病状态。

cAMP是细胞内信号传导最为常见的第二信使，参与调节成骨细胞的分化，并通过激活cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）发挥调节作用［14-15］。ERK1/2是MAPK家族的一员，具有酶促级联反应特点，在细胞信号传导通路中，ERK1/2可通过调节成骨细胞分化过程中重要的转录因子Osterix促进成骨细胞分化［15］。在本研究中，我们选用观察cAMP、PKA和ERK1/2作为反映成骨细胞生物活性的对象。PTH可通过其受体PTH1R激活腺苷酸环化酶，促进cAMP生成，进一步激活PKA调节靶基因的转录，参与成骨细胞的生长分化。我们采用外源性重组PTH（1-34）刺激体外培养的成骨细胞，在C57BL/6J小鼠原代成骨细胞中，cAMP、p-PKA、p-ERK1/2的水平明显升高，并呈剂量依赖性，说明外源性PTH（1-34）刺激成骨细胞，通过cAMP-PKA通路和ERK-MAPK通路促进了其生长分化。

我们的研究发现，与C57BL/6J小鼠不同，在KK-Ay小鼠体外培养的成骨细胞中，补充外源性重组PTH（1-34）未见cAMP、p-PKA、p-ERK1/2的水平明显上升，提示糖尿病肾病状态下存在抑制PTH效应的因素。研究［16］已经证实，Klotho是促进成骨细胞ERK1/2激活的重要因子，我们在KK-Ay小鼠体外培养的成骨细胞中加入外源性重组Klotho后证实，cAMP、p-PKA、ERK1/2水平明显上升。我们以前的研究发现KK-Ay糖尿病肾病小鼠骨组织Klotho表达明显下降。结合本研究结果，我们认为，在糖尿病肾病状态下骨组织中Klotho表达下降，单纯PTH刺激不能有效诱导成骨细胞增生分化，而在补充Klotho后，成骨细胞对PTH刺激恢复了反应，说明Klotho在PTH-成骨细胞反应中发挥了重要的作用。

综上所述，正常小鼠成骨细胞对PTH刺激反应性呈剂量依赖性上升，而糖尿病肾病小鼠成骨细胞对PTH刺激无反应；加入外源性Klotho可促进糖尿病肾病小鼠成骨细胞对PTH的刺激反应，这为我们进一步研究糖尿病肾病骨代谢异常的发生机制提供了重要的线索，也为干预糖尿病肾病低转化骨病提出了新的靶点。