保温和浇水处理对结缕草冬季胁迫的缓解作用

单旭东，高娅楠，张桐瑞，程 锦，许立新

(北京林业大学草业与草原学院，北京100083)

结缕草(Zoysiajaponica)因具有耐旱、耐盐碱、耐热、耐践踏、抗病、养护成本低等特性，在草坪草应用中深受欢迎，广泛用于公园、球场、公路护坡等绿地建植[1]，但其在北方冬季胁迫下较早进入枯黄期，这使其进一步推广使用受到限制。

研究者认为，造成草坪草冬季胁迫的两大原因是低温和干旱[2]。国内外已有许多学者对如何减小冬季胁迫和延缓草坪枯黄期进行了大量的研究[3]，如筛选抗寒基因[4-5]、培育抗寒品种、科学的控制水肥[6-7]、喷施激素[8-9]以及建设地下供暖系统对草坪加温[10-11]从而推迟草坪枯黄期。然而，这些方法存在不同程度的耗时、耗力、耗钱的问题。本试验采用省时、省力、省钱的保温和浇水的方法对结缕草进行处理，研究3种处理对冬季胁迫下结缕草生理生化特征的影响，探索结缕草冬季胁迫响应机制，为草坪保温技术提供应用参考。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2019年10月至11月在北京市昌平区北京林业大学草坪试验基地(东经116°14′，北纬40°10′)进行，该地区属于暖温带半湿润大陆性季风气候，平原地貌，平均海拔52 m，平均日照时数2 684 h，年均气温11.8℃，年均降水量550.3 mm。根据国家气象科学数据中心[12]查询得到试验所在地区近3年气温的变化对照(表1)。

表1 试验地所在地区近3年自然气温变化对比Table 1 Comparison of natural temperature change in the area where the test site is located in the past three years

1.2 试验材料

供试结缕草品种为‘Zenith’，原材料建植于2015年，建植方式为铺草皮。2019年6月进行草皮的移栽，在原草坪的中心区域取16个30 cm×30 cm面积的草皮，移栽至试验区域，试验小区面积为1 m2，小区间距50 cm。草坪移栽后按氮素施用量5 g·m-2在表层一次性施入缓释复合肥(N∶P2O5∶K2O =19∶6∶12)作为底肥，在此之后不再施肥。日常浇水养护，定期人工拔除杂草，每月修剪一次，修剪高度约为15 cm，横向自由扩繁。

1.3试验设计

采用添加保温棚的方式做保温处理。保温棚长宽高为1 m×1 m×0.5 m，骨架为不锈钢管，棚膜为PVC材质，无色透明，防风透光性良好，添加保温棚比覆盖聚乙烯薄膜更具优势，可以保留较高的修剪高度，不会对结缕草草坪造成物理压迫。

试验采用随机区组设计，共4个处理，分别是保温充足浇水处理(Temperature and Watering，TW)，保温不浇水处理(Temperature Preserture，T)，无保温充足浇水处理(Watering，W)，无保温不浇水处理即对照组(Control Check,CK)，每个处理4个重复，共有16个小区。2019年10月14日，进行保温棚的安装，10月14日至10月27日，每隔3天，将所有小区都充分浇水，每次浇水量统一为10 kg·m-2。10月27日起T和CK处理组停止浇水，TW和W处理保持充足浇水。分别在10月27日，11月1日，11月6日，11月12日，11月19日进行5次取样，取适量成熟展开叶的中间部分，放入自封袋并做好标记后放入冰盒保鲜，带回实验室立即测定生理指标。取适量成熟展开叶的中间部分用锡箔纸包裹并做好标记放入液氮中，带回实验室，放入-80℃冰箱保存，用于抗氧化酶活性的测定。

1.4 测定指标和方法

气温使用煤油温度计(型号：国标-20～100℃，厂家：衡水正旭电子科技有限公司)测定。土壤含水量(%)使用土壤水分速测仪(型号：TZS-Ⅰ，厂家：浙江托普仪器有限公司)进行测定。叶片相对含水量(relative water content，RWC)采用烘干法[13]测定。相对电导率采用Blum和Ebercode的方法[14]测定。单位面积叶片枯黄比例使用网格针刺法测定，调查200个1 cm2方格中枯黄叶片的方格比例，用于衡量植株进入枯黄的状态。叶绿素含量采用分光光度法[14]测定。丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[15]测定。抗氧化酶活性测定[16]：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性使用氮蓝四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)光化还原法(单位：U·g-1DW，DW(dry weight)代表叶片干重)，以观察甲棕的颜色为时间参考，观察直到样品管中溶液呈浅紫色，立即使用UV-2600分光光度计测定其在560 nm波长下测定内吸光度；过氧化物酶(peroxidase，POD)活性使用愈创木酚氧化法(单位：U·mg-1DW)，定义1分钟内吸光度每变化0.01为酶活性的一个单位(U)；过氧化氢酶(catalase，CAT)活性使用过氧化氢还原法(单位：U·g-1DW)，定义1分钟内吸光度每变化0.01为酶活性的一个单位(U)。

1.5 数据分析

使用Excel 2016 对数据进行整理和图表的绘制，使用SPSS 20.0对数据进行方差分析，同时以Duncan(邓肯)法对数据进行显著性比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 土壤含水量和气温的变化

T处理组和CK组土壤含水量随时间的变化而明显降低(图1)，T处理土壤含水量降低速度小于CK组，TW处理和W处理土壤含水量保持在25%～30%。TW和T处理气温高于W和CK处理组气温2.1～2.4℃(图2)。

图1 土壤含水量的变化Fig.1 The change of soil moisture content注：TW为保温浇水处理，W为浇水处理，T为保温处理，CK为空白对照。下同Note:TW is temperature and watering treatment,W is watering treatment,T is temperature treamtent. CK is control group,the same as below

图2 气温的变化Fig.2 The change of air temperature

2.2 单位面积叶片枯黄比例

随着冬季胁迫时间变化，所有处理组叶片枯黄比例均呈上升趋势(图3，图4)，10月24日各处理间单位面积叶片枯黄比例差异不显著。10月27日至11月6日，单位面积叶片枯黄比例由大到小依次是CK，T，W，TW。而11月6日后，枯黄比例从大到小依次是CK，W，T，TW。这表明，在10月27日至11月6日期间，浇水处理的效果大于保温处理。11月12日至11月19日，W处理单位面积叶片枯黄比例大于T处理，这说明11月6日之后，保温对结缕草枯黄的缓解作用大于浇水。

图3 保温和浇水处理对单位面积枯黄叶片比例的影响Fig.3 Effect of temperature preservation and watering treatment on the proportion of withered yellow leaves per unit area

图4 保温和浇水处理对冬季胁迫下结缕草叶片枯黄比例的影响Fig.4 Effects of heat preservation and water treatment on the ratio of withered and yellow leaves of Zoysia grass under winter stress

2.3 叶片相对含水量

冬季胁迫下，各处理组叶片相对含水量均呈下降趋势(图5)。10月27日和11月1日各处理间均无显著差异。11月6日，TW处理叶片相对含水量显著高于其他处理组(P<0.05)。11月12日，TW处理显著高于其他处理组(P<0.05)，W和T处理差异不显著，但显著高于对照组(P<0.05)。11月19日，W处理和T处理差异不显著，TW，W和T处理显著高于对照组(P<0.05)。11月6日，CK处理组叶片相对含水量比11月1日显著下降了5.04%(P<0.05)，11月12日，W和CK处理叶片相对含水量比11月6日均显著下降(P<0.05)。11月19日，TW处理相比前4次取样首次出现显著下降(P<0.05)，CK组叶片相对含水量显著下降(P<0.05)。从对照组叶片相对含水量的变化上可以看出冬季胁迫对结缕草叶片相对含水量有显著的影响。TW处理可以减少冬季胁迫对叶片相对含水量的影响。

图5 保温和浇水处理对叶片相对含水量的影响Fig.5 Effect of heat preservation and watering treatment on relative water content of leaves注：不同小写字母表示相同日期内，不同处理差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示相同处理不同日期间的差异显著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters show significant different between different treatments under the same date at the 0.05 level. Different capital letters indicated that there was significant difference between different dates of the same treatment at the 0.05 level,the same as below

2.4 相对电导率

冬季胁迫下，各处理组相对电导率均呈上升趋势(图6)，这表明冬季胁迫下，结缕草的膜透性加大，电解质渗透加剧。10月27日，各处理间差异不显著，11月1日T处理相对电导率出现显著增长(P<0.05)，该日T处理的相对电导率显著高于TW和W处理(P<0.05)，这表明在此时期水分对相对电导率的影响大于温度。在11月6日之后，由于温度持续降低，W处理相对电导率快速增长，其增长速度远大于T处理，说明在此期间，温度对相对电导率的影响大于水分。保温和浇水处理(TW)相对电导率较为稳定，TW组相对电导率始终低于T，W和CK组，由此可知，TW处理可以较好地缓解结缕草细胞膜的损伤。

图6 保温和浇水处理对相对电导率的影响Fig.6 Effect of heat preservation and watering treatment on relative electrolyte conductivity

2.5 叶绿素含量

冬季胁迫下，各处理叶绿素含量均呈下降趋势(图7)，其中CK组叶绿素含量下降速度最快，W处理组次之，TW和T处理组下降速度则较为缓慢。11月1日，W与CK处理叶绿素含量出现显著下降(P<0.05)，TW和T处理组显著高于CK组(P<0.05)。11月6日，TW与T处理叶绿素含量比11月1日均出现显著下降(P<0.05)，11月6日叶绿素含量从大到小依次是TW，T，W，CK。11月12日各处理间差异均显著(P<0.05)，叶绿素含量从大到小依次是TW，T，W，CK。11月19日TW组显著高于其他处理组(P<0.05)，T处理显著(P<0.05)高于W和CK处理，W和CK处理间差异显著(P<0.05)。

图7 保温和浇水处理对叶绿素含量的影响Fig.7 Effect of heat preservation and watering treatment on chlorophyll content

2.6 丙二醛(MDA)含量

随着冬季胁迫程度的变化，各处理MDA含量均呈上升趋势(图8)，由此可知，冬季胁迫下结缕草的细胞膜损伤逐渐加重。10月27日，W和CK处理组MDA含量显著高于TW和T组(P<0.05)。11月1日、11月6日、11月12日和11月19日TW处理组MDA含量都显著低于CK处理组。T处理在11月6日和12日MDA含量无显著差异，但高于W处理的MDA含量，这表明，在此期间，水分对MDA含量的影响大于温度。各处理中，保温浇水处理(TW)的MDA含量最低，这表明TW处理缓解了冬季胁迫对细胞膜的损伤。

图8 保温和施浇处理对丙二醛含量的影响Fig.8 Effect of heat preservation and watering treatment on malondialdehyde content

2.7 抗氧化酶活性

2.7.1SOD活性 10月27日TW与对照组间差异不显著(图9)，11月1日到11月19日TW处理组的SOD活性显著高于其他处理组(P<0.05)。11月1日浇水处理(W)相比10月27日显著下降443.97 U·g-1(DW)(P<0.05)，而T处理在11月1日显著下降了458.89 U·g-1(DW)(P<0.05)，这表明在此期间，温度和水分对SOD活性都有很大的影响。11月6日、11月12日期间，W处理组SOD活性的下降幅度大于T处理，且在11月12日之后，T处理的SOD活性都显著高于W处理(P<0.05)，这表明在冬季胁迫的后期，温度对SOD活性的影响大于水分。TW处理在所有处理中都维持在一个比较高的水平，由此可知，TW处理对冬季胁迫下结缕草SOD活性有显著的影响。

图9 保温和浇水处理对SOD活性的影响Fig.9 Effect of heat preservation and watering treatment on SOD activity

2.7.3CAT活性 冬季胁迫下，TW,W和T处理CAT活性均呈先升后降趋势(图11)，CK组CAT活性呈持续下降的趋势，表明冬季胁迫对结缕草CAT活性具有显著的影响。W和T处理CAT活性都在11月1日即出现显著上升(P<0.05)，TW处理CAT活性首次显著上升出现在11月6日(P<0.05)。11月6日至11月12日期间，W处理的CAT活性显著高于T处理(P<0.05)，11月19日，W处理的CAT活性显著低于T处理(P<0.05)。保温和浇水处理对冬季胁迫下结缕草的CAT活性具有显著影响(P<0.05)。

图10 保温和浇水处理对POD活性的影响Fig.10 Effect of heat preservation and watering treatment on POD activity

图11 保温和浇水处理对CAT活性的影响Fig.11 Effect of heat preservation and watering treatment on CAT activity

3 讨论

3.1保温和浇水处理对土壤含水量、气温和结缕草枯黄的影响

保温覆膜技术在草地早熟禾(Poapratensis)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)和花生(Arachishypogaea)等领域均有应用。研究表明，覆膜可以减小风力对温度的影响，与大气形成一定程度的隔离，从而增加温度、减少土壤水分散失[17-20]，这也在一定程度上解释了本研究中T处理土壤含水量下降速度小于CK组的原因。在隋虹杰等[21]的研究不同覆膜方式对高粱(Sorghumbicolor)生长发育的影响时发现，全覆膜处理可比不覆膜处理提升1.78～2.20℃，且全覆膜处理土壤含水量高于不覆膜处理，这与本研究结果相似，对草坪添加保温处理可减小土壤水分蒸散速度、提高气温。

单位面积草坪枯黄比例和土壤含水量存在关联性，土壤缺水会加快结缕草进入枯黄，当CK组土壤含水量低于5%时，其单位面积枯黄的比例为96.8%，W处理即使保证了水分供应，但因自然环境的持续降温，11月19日测得W处理的单位面积枯黄比例也达到了91.3%之高。刘立军等[22]的研究中，不同灌水水平处理下的高羊茅(Festucaarundinacea)枯黄率随着自然温度的降低都显著增加(P<0.05)。因此，冬季胁迫后期，水分不再是影响结缕草单位面积枯黄比例的主要因素，其主要因素可能是温度。

黄亮亮[23]的研究证实浇水处理能提高草坪草抗性，从而推迟枯黄期。本研究中对比W和CK处理发现，充足的浇水处理，能起到减缓结缕草叶片枯黄速度的作用，在11月6日之后，日均温开始低于10℃，结缕草枯黄的速度加快，李超等[24]认为结缕草的生长临界温度为10℃，当温度低于10℃时，结缕草将停止生长，并进入枯黄期，本研究进一步验证了这一观点。研究发现保温浇水(TW)对冬季胁迫的缓解效果最好，这是因为该处理一方面保证了水的充分供给，另一方面是提高了气温。

3.2 保温和浇水处理对冬季胁迫下结缕草生理指标的影响

W和T处理的叶片相对含水量在11月6日显著降低(P<0.05)，同时W和T处理在此后的日期中，叶片相对含水量均显著低于TW处理(P<0.05)，但W和T之间的叶片相对含水量差异不显著，这表明水分胁迫和温度胁迫均会使结缕草叶片相对含水量显著降低(P<0.05)，但还不能得出水分和温度哪种因素对叶片相对含水量的影响更大。T处理的叶片相对含水量在冬季胁迫的前期没有显著下降，而在冬季胁迫的后期随着土壤含水量和温度的下降，其叶片相对含水量也呈下降趋势。有相关研究发现，只干旱处理不会造成多年生黑麦草(Loliumperenne)叶片相对含水量的下降，而在低温下，干旱将造成多年生黑麦草叶片相对含水量下降[25]。保温和浇水处理(TW)对冬季胁迫下结缕草电解质渗透具有缓解作用，TW处理组相对电导率始终低于T,W和CK组，由此可知TW处理可以较好地缓解冬季胁迫对结缕草细胞膜的损伤。有研究表明，覆膜保温能提高‘张杂谷3号’(Setariaitalica)的抗旱能力，降低谷子在旱期的丙二醛含量[26]；还有研究表明，覆膜提高了高丹草(Sudanense)的水分利用效率，因此降低了水分胁迫对高丹草丙二醛含量的影响[27]；韩瑶[28]的研究证实冬季对葡萄(Vitisvinifera)进行覆盖，能减小冬季胁迫下葡萄的丙二醛增降幅度，提高葡萄越冬性能。本研究中，保温浇水处理(TW)对丙二醛的缓解效果最显著(P<0.05)，这是因为保温和浇水提高了结缕草冬季胁迫下的代谢水平，减小了冬季胁迫对细胞膜的损伤。

范丽霞[29]的研究发现，随干旱胁迫时间的延长，结缕草叶绿素含量降-升-降的变化趋势。而隋永超等[30]的研究表明，当土壤含水量下降到2%时，结缕草叶片叶绿素含量并没有显著下降，干旱条件下与正常浇水的结缕草叶绿素含量差异不显著。本研究中通过观察T处理的变化趋势可知，叶绿素含量随土壤含水量降低而降低，这与前人的研究结果不一致，这可能与试验中的胁迫条件不同有关，T处理除土壤含水量降低的因素以外，在冬季胁迫的后期也存在温度逐渐降低的因素，因此叶绿素含量逐渐下降。这也可能与结缕草叶龄有关，有研究指出植物光合作用的减弱与叶龄存在关联性，衰老相关基因SAGs (senescence-associated genes)随着叶龄的增加而表达水平上调，进而调控叶片衰老及细胞死亡，同时季节更替也是影响叶片叶绿素含量的重要因素之一[31]。本研究中在10月27日，W与T处理的叶绿素含量差异不显著，而在11月6日之后，T处理的叶绿素含量始终显著高于W处理(P<0.05)，这表明，结缕草叶绿素的代谢响应，在冬季胁迫整个过程中对温度比对水分更加敏感。

3.3 保温和浇水处理对冬季胁迫下结缕草抗氧化酶活性的影响

SOD是生物体系中抗氧化酶家族的重要一员，它能够催化超氧化物质产生歧化反应，使体内超氧化物质在维持一定水平，从而保护细胞[32]。冬季胁迫下，W处理组和对照组SOD活性呈减持续降低的趋势，侯祯丹等[33]研究低温胁迫对3种绿绒蒿(MeconopsisSPP.)生理生化指标的影响时发现，在人工模拟低温(4℃)条件下，3种绿绒蒿的SOD活性均呈先升后降的趋势，对比这两种SOD的变化趋势有所不同，这有两种可能，一是本研究中的温度胁迫是一个自然环境下的动态胁迫，而不是人工设定的持久性的、固定的低温胁迫，因此SOD的变化趋势有所不同，另一种情况可能是不同物种SOD对温度胁迫的响应机制不同。虽然T处理提高了温度，但是随着土壤含水量的逐渐降低，T处理产生了水分胁迫，SOD活性持续下降，活性氧与酶系统的平衡被打破与水分胁迫有关，水分胁迫下植物细胞受损加重。有研究指出，水分胁迫诱导的膜脂过氧化是体内活性氧ROS积累量超过一定的阈值而引起的，膜磷脂分子的多聚不饱和酸(亚油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸)的不饱和双键容易遭受羟基自由基的攻击发生过氧化链式循环反应[34]。本研究中取样时间主要包含了日均温高于10℃，低于10℃，低于0℃3个阶段，在这5次取样的时间中，CK处理组的SOD活性均存在显著差异(P<0.05)，这表明结缕草SOD的响应机制对冬季胁迫是较为敏感的。

冬季胁迫下，CK处理的CAT活性呈连续显著下降的趋势(P<0.05)，表明结缕草CAT响应机制对冬季胁迫较为敏感，结缕草对H2O2的清除能力减弱，亦或因为过氧化氢的积累和清除的平衡被打破，研究者认为一定水平的过氧化氢可以作为信号分子，在植物对逆境胁迫响应过程中担当重要角色，有助于植物启动相关基因的表达，而过量的H2O2会导致过氧化作用，引起细胞膜受损，严重时细胞则死亡[37]。TW,W和T处理组CAT活性均呈现先升后降的趋势，而10月27日，CK处理CAT活性就已经显著高于其他处理组(P<0.05)，这可能是因为CK组较早接受了温度和水分的复合胁迫，CAT已经结束了前期增长的阶段。T处理在11月1号出现显著上升(P<0.05)，而W处理上升不显著，这表明在此期间，水分对结缕草CAT活性影响大于温度。在11月1至11月12日，T处理的CAT活性显著下降了2 674.43 U·g-1(P<0.05)，而W处理在此期间下降了1 271.63 U·g-1，这表明在此期间水分对CAT活性的影响大于温度，可以确定的是TW在CAT活性在4种处理中其出现显著升高或降低趋势的时间最晚，到11月19日CAT活性显著高于其他处理(P<0.05)，为3 424.09 U·g-1，因此，保温浇水(TW)对结缕草CAT的响应有显著的影响。

4 结论

保温处理和浇水处理均能缓解冬季胁迫，保温和浇水能减缓叶绿素分解速度，缓解冬季胁迫对结缕草细胞膜的损伤，推迟结缕草进入枯黄期。总体而言，在冬季胁迫的前期，水分因素在冬季胁迫中的发挥的作用大于温度，冬季胁迫的后期，温度的发挥的作用大于水分。保温浇水处理对冬季胁迫的缓解效果最佳，能够显著推迟结缕草的枯黄期，起到保温保绿的作用。