黄芪-丹参药对治疗缺血性脑卒中研究进展

陈雨菡，马善波，杨 倩，李 龙，王 锦，缪 珊，石小鹏

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046； 2.空军军医大学西京医院药剂科，陕西 西安 710032)

缺血性脑卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)是一种缺血性脑血管疾病，临床表现为走路不稳、口歪眼斜，甚至突然晕倒，产生意识障碍等。据《2018中国脑卒中防治报告》显示脑卒中已成为我国成人第一死亡原因，也是成人残疾的首要原因[1]，伴有高发病率、高复发率、高病死率的特点[2]。随着分子生物学的发展及临床科研研究的深入，人们对缺血性脑卒中的病理生理学发病机制有了更深入的认识，促血管内皮新生、抗炎抗氧化、抗血栓及血脑屏障保护及抑制细胞凋亡已成为抗缺血性脑卒中的治疗新策略。

我国传统中医药对缺血性脑卒中的治疗历史悠久，积累了丰富的治疗经验。中医称缺血性脑卒中为“中风”，与《黄帝内经》中描述“薄厥”“大厥”“煎厥”以及“偏枯”的记载相似，总属病因为气血逆乱。明朝著名医学家楼英称中风病为“卒中”，清朝医学家张锡纯首次提出了“脑充血”以及“脑贫血”的论点，其中“脑贫血”与现代医学描述“缺血性脑卒中”的发病机制相一致[3]。中医认为脑卒中病变核心是“气虚血瘀”。“气虚”是发病之本，“血瘀”乃病发展之核心[4]。气是维持血液在体内运转的动力，血是气的滋养，载运不致耗虚。气虚，血运行无力，则致血瘀，故运用益气活血方是治疗缺血性脑卒中的重要方法。中药治疗脑卒中用药规律表明，黄芪和丹参使用频率位于前列且为重要药对[5]。黄芪具有补气固表，托疮生肌的功效，为“补气之最”，常见于治疗“气虚血瘀症”的方剂之中，特别是清代名医王清任创制的补阳还五汤最具代表性[6]。《本草纲目》记载丹参具有“补新血，调经脉”的功效[7]。目前临床上有许多黄芪-丹参药对佐证报道。陈家权等[8]认为缺血性中风的主要病机是气虚血瘀，黄芪、丹参等以益气活血、化瘀通络为治病法则，疗效良好。姜德远[9]通过对70例脑梗死恢复期患者研究表明，黄芪丹参汤对脑梗死恢复期患者疗效较好。刘金栋[10]通过66例急性脑梗死患者临床治疗发现，黄芪-丹参合用对急性脑梗死疗效显著，恢复神经功能，并有助于改善预后。因此，黄芪-丹参药对中黄芪为补气之王，能益气补虚；丹参为调理血分之首药，偏于活血则活血化瘀，黄芪得丹参相佐，生新而不留瘀，丹参得黄芪之助，活血之力倍增，两药配伍，协同增效相得益彰。

黄芪甲苷、黄芪多糖、毛蕊异黄酮、丹参素、丹参酸、丹参酮等是黄芪-丹参药对中主要的药效物质。现代医家通过基础研究和临床研究证实，对于缺血性脑卒中患者的治疗，黄芪-丹参药对可以在抑制脑血管内皮凋亡及损伤、促进血管内皮新生、抗炎、抗氧化、抗血栓及保护血脑屏障等方面发挥作用。本文主要基于益气活血的中医理论，综述黄芪-丹参药对及其有效成分上述诸作用，以期为在缺血性脑卒中的临床治疗和应用中积累经验。

1 黄芪-丹参药对抑制缺血性脑血管内皮损伤和凋亡

当前，对于缺血性脑卒中的治疗策略，临床上还是以早期的溶栓治疗为主。虽然这种方法可以有益于患者的血管再通，但是缺血再灌注能导致严重的多器官、组织的损伤，甚至影响患者预后效果。缺血性脑卒中患者再灌注损伤的机制现还未完全阐明，普遍认为是由于在缺血性脑卒中发生超过最佳治疗时间窗时，相应区域内的内皮细胞由于长时间的缺氧、缺血则会发生变性、坏死，而在这时恢复灌注反而会导致脑血管神经元损伤进一步加重，脑组织水肿加重，从而进一步释放炎性因子如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(Interleukin6，IL-6)等，同时明显上调黏附因子表达，引起白细胞的聚集、浸润，导致血管堵塞，且白细胞释放的氧自由基会损伤内皮细胞，使脑损伤进一步加剧，形成恶性循环。因此，减少大脑内皮细胞损伤和凋亡就成为了控制缺血性脑卒中恶化的关键。而黄芪-丹参药对以及其有效成分可通过抑制脑血管内皮损伤、促进脑血管内皮增殖等，从而对治疗缺血性脑卒中起到有效的作用。

1.1 黄芪-丹参药对抑制脑血管内皮细胞凋亡 脑血管内皮细胞在组织细胞和血液中形成半通透屏障，是单层连续覆盖于血管内层的扁平细胞。缺血性脑卒中引起的脑血管缺氧、缺血等刺激均可导致血管内皮细胞的氧化应激反应以及通过线粒体途径凋亡，紧密连接蛋白被破坏，细胞外基质降解量增多或合成障碍。

崔伟等[11]发现黄芪甲苷处理H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞，能够减少内质网应激，并且还可以激活低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor，HIF-1)，使缺氧诱导的内皮细胞凋亡得到有效控制。Tang等[12]验证丹参多酚酸对大鼠MCAO模型的治疗作用，在进行60 min再灌注之前施用注射用丹参多酚酸(1.67 mg/kg)经股静脉注入，再灌注后24 h，结果表明丹参多酚酸可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，支持其临床应用于急性缺血性卒中的治疗。丹参多酚酸可减轻I/R所致的微循环障碍和神经元损伤，与激活AMPK，抑制NADPH氧化酶亚基的膜转位，抑制Akt磷酸化和PKC转位有关。有研究表明[13]，注射用丹参多酚酸孵育人外周血来源内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)后，通过调节其增殖、黏附和NO分泌活性，促进血管EPCs存活及血管新生，24 h后最多可增加至为5 mg/L(P<0.01)。黄芪-丹参药对配伍能有效激活PI3K/Akt信号通路，激活HIF-1，改善脑微循环障碍和神经元损伤，增加EPCs的增值与黏附，调节NO分泌活性，从而抑制脑血管内皮细胞凋亡。

1.2 黄芪-丹参药对促进脑血管内皮细胞增殖 缺血性脑卒中会严重导致脑细胞缺血缺氧，而随着缺氧情况愈演愈烈，对脑血管内皮细胞的增殖和代谢的抑制也渐渐加强，血管内皮细胞不仅是平滑肌细胞与血液之间的屏障，还具有强大的内分泌功能，可以释放各种各样的活性物质参与人体的各种生理病理过程。

李军昌等[14]发现，黄芪甲苷可以稳定组织中HIF-1以及血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，促进人体快速新生血管和促进血管成熟，并且构成具有效灌注功能的微脉管，使人体的血液和氧气供应得到一定程度的改善。Liang等[15]研究发现，黄芪甲苷可显著缩小心肌梗死面积，促进细胞增殖和导管形成，继而实现促进血管生成和缺血性脑损伤后的脑保护作用。这与通过上调miRNA-210的表达、诱导HIF-VEGF-Notch信号通路的激活、抑制靶基因ewitinA3的表达密切相关。丹参中丹酚酸B有促进内皮祖细胞黏附的作用，赵先锋等[16]的研究表明，100 g/L丹酚酸B能够使内皮祖细胞附着率明显提高，并促使白细胞介素-8 (Interleukin-8,IL-8)和基质细胞衍生因子-1 (Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)等细胞活性因子的水平上调，优化侧支循环的组织血液供应。李耀汝[17]建立小鼠MCAO模型，并观察脑缺血后血管生成调控情况，注射用丹参多酚酸连续治疗14 d，结果表明丹酚酸可以调节VEGF、血管生成素-1(Angiopoietin，Ang-1)和Ang-2的表达，使脑缺血后新血管的重塑加快，该机制可能与JAK2/STAT3路线有关。丹参多酚酸可激活血管生成过程中JAK2/STAT3信号通路，促进卒中后血管生成和神经功能恢复的影响，并取消促血管生成因子的介导作用[18]。在以往的研究中，很多研究者都提出黄芪、丹参的提取物进行配伍可以调控促血管生成因子，黄芪丹参的水煎液还能激活腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)[19]。黄芪丹参进行配伍还可以通过抑制脑内微血管内皮细胞系非编码长链RNA的表达，上调VEGF、VEGFA2的表达促进血管内皮细胞新生[20]。

2 黄芪-丹参药对抗炎、抗氧化作用

缺血性脑卒中发病过程中会由于脑缺血等原因，造成坏死区周围缺血半暗带的组织供血不足,造成细胞的衰老或死亡，导致超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的水平显著降低，清除氧自由基能力下降[21]，大量的氧自由基能够对蛋白活性和细胞功能产生影响，导致细胞损伤。死亡的内皮细胞还可释放黏附因子、趋化因子、细胞因子等物质，促使白细胞黏附、趋化运动，最终导致多种炎症因子的释放，发生大炎症反应。炎症反应的发生以及氧自由基的增多引发的细胞进一步坏死和血管腔堆积在缺血性脑卒中的发病过程中起着重要的作用。

低密度脂蛋白的氧化可导致内皮细胞部分炎症性反应。黄芪甲苷治疗能逆转脑组织丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平升高，神经细胞凋亡，半胱氨酸天冬氨酸蛋白-3(Caspase-3)裂解，脑水肿，SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性降低[22]。这表示，黄芪甲苷能够减少氧化应激反应的发生，清除自由基，减轻缺血脑组织损伤程度[23]。Xu等[24]研究发现黄芪甲苷也能显著提高缺氧/复氧诱导的细胞SOD活性，显著降低MDA活性和活性氧的产生。因此，黄芪甲苷抑制内质网的氧化应激，大大避免了氧自由基对血管内皮的直接损伤，及其诱发的炎性反应对血管内皮造成的间接损伤害。用于注射的丹参多酚酸具有明显增加两种SOD的活性并减少MDA含量的多种活性成分，清除自由基损伤，大大增强机体抗氧化损伤的能力，从而发挥良好的脑保护作用[25-26]。注射用丹参多酚酸减弱了Toll样受体4和核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号传导途径，以减少炎症因子IL-1，IL-6和TNF的表达[27]。Fan等[28]评价丹酚酸对脑I/R损伤的脑保护作用时，通过TTC染色和磁共振成像分析显示，丹酚酸B能显著缩小脑梗死面积，并能改善神经行为功能，同时可减少活性氧的产生，显著降低缺血再灌注损伤脑组织胶质纤维状酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、Iba1、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、TNF-α和Caspase-3的表达。免疫组织化学染色显示，丹酚酸还可抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化，提示丹酚酸B对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，可作为临床治疗的有效候选药物。黄芪、丹参经过一定的浓度进行配比以后，可以影响NF-κB和Nrf2信号通路的调控作用，从而起到抗炎以及抗氧化应激损伤的作用[29]，黄芪丹参颗粒能使脑组织内转化生长因子(Transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、p38MAPK信号通路、Caspase-3 mRNA及蛋白表达明显减少，从而治疗应激损伤部位，有效保护缺血性脑卒中患者的脑组织。

3 黄芪-丹参药对抗血栓形成作用

正常的情况下，血流中的血小板是不黏附于血管壁的。但当血管壁的内皮受损伤，血小板活化因子和凝血酶等和血小板结合，导致血小板膜糖蛋白的构象发生改变[30]，与纤维蛋白原结合，从而形成血小板凝集造成附壁血栓。如处理不及时，血小板凝集块的表面上就会进一步形成纤维蛋白网，网入红细胞和白细胞致使血栓扩大，导致脑血管内腔闭塞，最终发生缺血性脑梗塞。

黄志恩等[31]的研究显示,补阳还五汤能使游离的CD63与CD62P蛋白的表达下调，降低患病大鼠神经受损的程度并减少面积，其剂量和效应之间的关系十分明显，对今后研究补阳还五汤中有效成分黄芪抗血栓的形成有很大的启发作用。华晓东等[32]借助生物标志物检测方法，评估了丹参多酚酸注射液对血小板活性的影响。由试验结果可知，丹参多酚酸注射液能够显著抑制血小板上由二磷酸腺苷所激活的P-选择素较高水平的表达，并抑制血小板的活化能力。Liu等[33]通过检测ADP诱导的血小板表面PAC-1结合和P-选择素的表达来评价丹酚酸酯对急性冠脉综合征患者血小板的影响，结果发现丹酚酸酯可显著增强标准双重抗血小板治疗的抗血小板作用。丹酚酸B是丹酚酸酯的主要成分，占丹酚酸酯的85%。丹酚酸B通过抑制磷酸二酯酶(Phosphodiesterases，PDEs)和拮抗P2Y12受体，在体外抑制多种激动剂诱导的人血小板活化。杜冠华等[34]实验发现丹酚酸A(1 μmol/L)在体外给药能够抑制胶原蛋白、二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)以及在花生四烯酸油脂的作用下出现的血小板凝集。体内用丹酚酸A(6 mg/kg)可以使在胶原蛋白作用下出现的血小板凝集全部消失；10 mg/kg丹酚酸A可以对在ADP作用下出现的血小板凝集起到明显的作用，证明丹参有改善缺血性脑卒中的作用。

丹参、黄芪以及两药合用会对脑缺血再灌注后脑组内Bcl-2蛋白表达产生影响，从而防止脑血栓的生成。黄芪注射液配伍丹参注射液可以明显升高气虚血瘀大鼠脑组织中VEGF、bFGF mRNA的表达，黄芪-丹参药对配伍能使t-PA维持正常水平，这也是限制缺血性脑卒中患者血栓发展的重要因素之一，黄芪-丹参药对还可以通过影响血小板膜糖蛋白的表达等途径限制血栓扩散，在缺血性脑卒中治疗中起到良好的效果[35]。

4 黄芪-丹参药对血脑屏障保护作用

血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)在缺血性中风的发病机制中起到的特殊作用，逐渐成为临床医学家关注点。缺血性中风发作后，内皮之间缺乏紧密连接蛋白会引起血脑屏障在短时间内被破坏，从而导致血管性脑水肿，而且这种破坏往往是持续的，贯穿缺血性中风的急性期到亚急性早期。在缺血性脑卒中情况下，BBB的破坏意味着患者临床结果出现了恶化，例如出血性转化。要使血脑屏障结构和功能保持正常必须使毛细血管和内皮之间紧密的相连在一起。

研究发现，黄芪甲苷能够维持血管壁结构和功能稳定，作用的机制是显著下调缺血再灌注后脑组织中基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloprotein-9，MMP-9)蛋白的表达，从而抑制细胞外基质的溶解，而对缓解血管源性脑水肿起到了显著的效果。Claudinscl是毛细血管和内皮细胞之间的紧密连接的跨膜蛋白，其能够调节内皮细胞相互之间的黏附、极性和屏障功能，并参与细胞外基质的降解。 Claudin-5是在内皮细胞与细胞接触处发现的紧密连接蛋白，对维持脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells，BMVEC)完整性至关重要。朊病毒蛋白质(Prion protein，PrP)是一种表面黏附分子，在各种细胞类型的连接处表达，包括BMVEC，是BBB的重要组成部分，Megra等[36]发现TNF-α和VEGF降低了BMVEC的表面PrP，进一步发现PrP减少导致Claudin-5的表达减少。TNF-α增强构成血脑屏障的脑毛细血管通透性。Claudin-5是一种关键的蛋白，其在脑内皮细胞中的表达对血脑屏障的功能起着至关重要的作用。Aslam等[37]发现黄芪甲苷能调控单独过表达NF-κB亚单位p65可抑制小鼠脑内皮细胞中Claudin-5启动子的活性。在原代培养的小鼠脑内皮细胞中，观察到长时间的TNF-α作用后 Claudin-5蛋白表达的部分缺失，证实了TNF-α诱导的小鼠脑内皮细胞 Claudin-5表达下调。因此，推测黄芪甲苷能够通过以上机制维持毛细血管内皮紧密连接结构和功能的完整性。已有研究表明，丹参能够下调MMP-9的水平和上调金属蛋白酶的组织抑制剂-1(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)水平，从而大大减少血脑屏障的损伤。Wu等[38]通过用血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang2)刺激周细胞建立高血压的体外模型，丹酚酸A以剂量依赖性方式减弱血脑屏障通透性。它下调大脑外周细胞中的促凋亡蛋白，包括p53，p21，Fas，FasL，caspase 3和Bax，并上调CDK6，cyclin D1，CDK2，cyclin E和Bcl-2。这可能与丹酚酸A通过增加Ras，Raf，p-MEK1，p-MEK2，p-ERK1和p-ERK2等蛋白的水平以剂量依赖性方式激活Ras/Raf/MEK/ERK途径，减少Ang2诱导的脑微血管周细胞凋亡，降低细胞周期G0/G1期细胞比例有关。黄芪甲苷和丹参酮配伍可明显抑制缺血性脑损伤的大鼠脑组织含水量进一步上升，使MDA、IL-1β、TNF-α含量降低从而抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表达，使SOD、CAT的活性增加，并且上调紧密连接蛋白ZO-1的表达。相关的研究表明[39]，在中医传统的针灸治疗的基础上配合黄芪-丹参药对，可明显使ZO-1、Claudin-5、JAM-A蛋白表达水平升高。黄芪-丹参药对还可以通过调控蛋白以及一些炎性因子的表达，对血脑屏障起到一定的保护作用，从而治疗缺血性脑卒中。而在西药环孢菌素A的基础上加用黄芪丹参颗粒可以使脑组织水含量及伊文思蓝漏出量大大减少，表明黄芪-丹参药对能够有效保护血脑屏障。

5 结 语

缺血性脑卒中患者可能出现认知功能障碍和运动功能障碍，如果缺血性脑卒中的发病部位在额叶、海马等部位，将会导致患者的智能显著下降，运动功能受到影响则会出现偏瘫，严重影响患者日常生活。除此之外，如果缺血性脑卒中面积较大，则会导致患者意识模糊，行动出现障碍，甚至危及患者的生命。近年来，越来越多的研究表明，该疾病运用中医辨证活血化瘀药治疗效果显著，而黄芪-丹参药对及主要成分以其可以通过多种作用保护血管内皮和抑制细胞凋亡、抗炎、抗血栓以及保护血脑屏障，从而有望成为中医药治疗缺血性脑卒中的重要药物。

黄芪-丹参药对能够抑制内皮细胞凋亡，加快内皮细胞繁殖和迁移、使每个细胞间的连接蛋白得到充分的表达并且可以提高细胞自身抵抗疾病的能力从而使其能够更好的起到保护血管内皮的作用，维持血管内皮屏障功能和促进血管再生,抵抗炎症和氧化过激以及改善认知功能的药用价值也尤为突出。但是，黄芪丹参药对的药理作用的研究仍尚未全面展开，目前研究的主要方向还集中在心血管疾病上，其他疾病诸如神经退行疾病、脑血管疾病、神经免疫性疾病等的研究还相对较少，且大多数都还停留在基础研究阶段，临床应用较少。因此，深入研究黄芪-丹参药对对神经细胞等的保护作用机制，以及保护血管内皮的作用靶点，将对心脑血管疾病的治疗和脑部疾病的预防产生重要价值。