体外诱导羊膜上皮细胞转分化为雌性生殖细胞的实验研究

刘心蕊，蒲静，李雪，潘朋歌，张宁

（宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，宁夏 银川 750004）

0 引言

近年来，在社会、环境及个人等多方面因素的综合影响下，全球范围内不孕不育的发病率不断提升，由此也引发了全球医疗的广泛关注。目前对于不孕不育的治疗，临床上所应用的辅助生殖技术虽然种类很多，但对于生殖细胞缺陷诸如卵巢早衰的患者始终无法达成很好的治疗效果。早在2003年国外研究人员就成功的从胚胎干细胞体外诱导出了卵母样细胞，由此也对诸多的不孕患者带来了全新的生机与希望。但需要强调的是胚胎干细胞高表达端粒酶具有着较为突出的致瘤性。此外，还有研究证实，羊膜上皮细胞同样具有着突出的多样性特点，同时能够表达潜能干细胞特定的转录因子，但对于干细胞中的端粒酶基因并不能表达，其来源又源自于废弃胎盘，并无伦理学争议[1-2]。而且，从大量的体外研究也均有力的证实了hAECs所具有的向3个胚层细胞分化的能力。对此，本次研究特使用人卵泡液为诱导剂，针对hAECs的作用从生态学和基因蛋白水平进行了观察，旨在为生殖细胞缺如女性不孕患者的治疗提供可靠参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料。采用我院产科近1年行剖宫产分娩的健康产妇胎盘组织，经血清学和病毒学检测结构呈阴性，并从经辅助生殖技术体外受精助孕的妇女中提取卵泡。研究均经患者知情且同意。此次研究中所应用的主要试剂包括：DMEM低糖培养基、胎牛血清、人上皮生长因子、胰蛋白酶、PCR引物、PCR试剂盒、DAZL山羊多克隆抗体等。

1.2 实验方法

1.2.1 hAECs分离培养及鉴定：针对羊膜与绒毛膜进行钝性分离，并将其放置于含有双抗的培养液中进行反复多次冲洗。冲洗完毕使用眼科剪将其剪成小块，随即加入37℃、0.05%的胰蛋白酶，震荡消化处理10 min。随后将上层清液吸除，再加入37℃、0.05%的胰蛋白酶震荡消化30 min.结束后再使用10%血清的DMEM培养基进行终止消化处理。随即使用网筛过滤取200×g细胞悬液，并进行4℃恒温离心处理10 min，后以1×107密度于培养瓶中接种，并将其放置于5%、37℃的是否为无菌细胞培养箱中进行培养2～3 d。随后进行换液，待培养细胞增长至80%融合后传代。使用显微镜针对原代细胞细胞形态变化进行观察，并采用RT-PCR和免疫细胞化学进行检测证实，证明：原代hAECs能够实现上皮细胞特异性细胞角蛋白19和Oct-4基因的表达。

1.2.2 hAECs的诱导分化处理：选取已完成细胞融合80%的第一代hAECs，均分对照组与诱导组两组并给予差异化处理，其中对照组EMMA培养基中含5%的胎牛血清、5000U 肝素钠以及2 mmol/L的L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L的非必需氨基酸、0.1 mool/L的β-巯基乙醇，观察组中在对照组添加的基础上再添加5%的人工卵泡。两组培养基每间隔3 d进行1次更换。针对培养基用域E2检测含量检测的上清液进行收集，并再显微镜下针对两组细胞形态变化进行观测，在诱导两周后（14 d）针对两组细胞总RNA和蛋白进行分别搜集。

1.2.3 RT-PCR检测基因表达：对所搜集的两组RNA，依据逆转录试剂盒说明书进行cDNA合成，并在定量PCR仪上使用PCR试剂盒进行PCR扩增，具体反应条件为：DAZL基因 95℃ 2 min，95℃ 10s，56℃ 10 s，72℃15s，总计39个循环。GDF9与SCP3和β-actin反应条件为95℃ 2 min，95℃ 10s，56℃ 10s，72℃ 15s，同样供39个循环。针对PCR产物经琼脂糖凝胶电泳处理，针对增产物的纯度、GDF9、SCP3、DAZL基因表达进行观察。针对内参基因β-actin与目标基因的比值进行计算。

1.2.4 蛋白表达检测：待完成14d的诱导处理之后，使用含有coktail的蛋白裂解液RIPA分别对两组细胞进行诱导裂解处理，待经超声离心处理后对其蛋白上清进行收集，并针对两组的蛋白浓度使用紫外分光光度计进行测定，并使用凝胶成像扫描系统完成扫描。以DAZL与内参β-actmin的光密度比值界定为DZAZL蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理。所有实验均重复进行3次，最终结果以（±s）表示，组间差异使用χ2检验，P＜0.05，说明组间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 hAECs形态学特征与鉴定结果分析。结果显示，原代hAECs生长较快，经2～3 d的培养后可达成80%～90%的高度融合。当原代hAECs传递至第3代之后，细胞生长速度与贴壁率下降明显，hAECs由于端粒酶的缺乏无法实现无限增殖，故后续实验特使用1代hAECs代替。

2.2 培养上清液中E2水平变化观察。经化学发光免疫检测技术检测显示，在14d的诱导处理过程中，对照中并无E2生成，诱导组中存在E2生成，其基础含量经测定约为（1.76±0.08）×104PG/ML，至第4其含量降至（0.96±0.06）×104PG/ML，随后呈现逐步增加趋势，至诱导第10d达到最高值，为（2.55±0.07）×104PG/ML。

2.3 RT-PCR检测生殖细胞特异性基因表达分析。在经过14 d诱导处理后，含由5%人卵泡液的诱导组与对照组相比，生殖细胞特异性基因GDF9和DAZL的mRNA含量明显较高，P＜0.05，而SCP3的mRN表达量则无明显差异，P＞0.05。

2.4 Western blot检测与DAZL蛋白表达。结果显示，经14 d诱导处理后诱导组DAZL基因表达水平为（0.704±0.031），而对照组为（0.172±0.03），P＜0.05。

3 讨论

随着现代医疗技术的不断发展，胚胎干细胞向生殖细胞分化的实现也使得通过干细胞一直来治疗不孕不育成为了可能。人羊膜上皮细胞，源自于受精8d后的原肠胚形成之前的外胚层，也具有了原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性。通过查阅近期研究也可发现，hAECs在不同的微环境调控与生长因子刺激下是可以分化为3个胚层不同类型细胞的，也能够完成多潜能干细胞特定转录因子oTC-4和Nanog的表达，由此也说明hASCs具有了与ESCs类似的多向分化功能。此外，hASCs不能对干细胞的端粒酶基因进行表达，因此也不具备无限增殖的功能和致瘤性。此外，国内研究表示，人工羊膜上皮细胞具备抗炎因子分泌功能，因此也能够有效的预防移植后炎症反应的发生[3-4]。

在此次研究实验中，使用人卵泡液为诱导剂，在经历为期14d的诱导之后，通过对细胞融合生长的观察发现，其形态学改变与前人研究成果高度一致。结果显示，DAZL基因在生殖细胞的发育早期就已经开始表达，属于减数分裂前期生殖细胞的标志基。GDF9属于卵母细胞分化后期的特异标志，而SCP3则是对哺乳动物减数分裂转变检测的高度特异性标志。在实验中通过RT-PCR技术针对诱导组细胞进行检测，发现生殖细胞特异性基因（GDF9、DAZL）的mRNA表达水平相对较高，而SCP3的基因表达则于对照组无明显差异，并通过使用Western blot方法对DAZL蛋白表达水平的检测发现，对照组基因表达量相对较高。由此也有力的证实了：人卵泡液能够实现在体外诱导hAECs向雌性生殖细胞方向成功转化，但该细胞并不具备减数分裂的能力。

总而言之，通过此次研究可以得出结论：人工卵泡能够诱导hAECs向雌性生殖细胞方向转分化，由此也为生殖细胞的体外诱导分化提供了一种全新的干细胞来院，为不孕不育患者的治疗带来了全新的生机和希望。但需要明确的是，在此次研究中卵细胞生成并未明确，而且所身生成的生殖细胞也不具备减数分裂的能力，因此无法得到成熟的卵细胞，这也是需要后期投入更多的时间和精力去深入探索研究的。