抑制树突细胞MMP-13基因对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样炎症模型的影响

韩 阳 张芯蕊 陈 娟 刘文琪 李晓东

沈阳医学院附属中心医院，沈阳，110024

银屑病是一种以红斑、鳞屑为主要表现的自身免疫性炎症性疾病，该病难以治愈，常反复发作，严重影响患者生活质量。银屑病病因复杂，受遗传、感染、外伤、精神、自身免疫、环境变化等多种因素影响[1]。免疫功能异常在其发病中具有重要作用，研究发现，T细胞、树突状细胞(dendritic cells，DC)、角质形成细胞及他们分泌的细胞因子共同参与银屑病发病[2]。

目前认为，银屑病是T细胞免疫功能紊乱、Th1细胞过度活化的自身免疫性疾病。DC是体内抗原递呈功能最强的细胞，未成熟的DC从外周迁移到皮肤，在启动T细胞介导的特异性免疫应答中起关键作用，并且能调控T细胞向Th1样或Th2样细胞方向发育，因此，DC在银屑病发病机制中的作用越来越受到重视。基质金属蛋白酶(MMPs)属于锌内肽酶家族，参与多种不同的细胞过程。它们可作为酶降解细胞外基质蛋白，同时也参与多种免疫反应[3,4]。MMP-13是胶原酶亚家族成员之一，主要在软骨细胞和成骨细胞以及多种肿瘤细胞中表达[4,5]。最近研究发现，MMP-13也在小鼠骨髓来源的DC和小鼠肺DC中表达。小鼠体外细胞学研究发现,MMP-13可调节DC的多种功能，包括激活CD8+T细胞，参与MHC-I表面表达，当DC细胞MMP-13表达受抑制时，其分泌的细胞因子IL-12p70、IL-23p19、IL-6减少[3]。许多研究发现，IL-6是银屑病细胞因子网络中的关键成分，参与银屑病的发病，并且与浸润的细胞成分和角质形成细胞的增殖有关，IL-23在银屑病的维持和发展过程中均发挥一定的作用[6,7]。IL-17A是辅助性T细胞17分泌的细胞因子，在银屑病发病中起重要作用[8]。

目前尚无描述DC细胞表达的MMP-13与银屑病之间相关性的研究。因此，我们应用Cre-lox系统构建DC特异性敲除MMP-13基因的小鼠模型分析DC细胞的MMP-13基因对银屑病的影响，初步探索DC细胞表达的MMP-13在银屑病发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选用12周龄的雌性C57BL/6小鼠(WT)和Cre-lox系统构建DC特异性敲除MMP-13基因小鼠(MMP-13LOX/LOX小鼠)(C57BL/6背景)作为研究对象。

1.2 仪器与试剂 5%咪喹莫特乳膏(艾达乐，3M，美国)，凡士林乳膏(强生，美国)，4%甲醛固定液(辽宁新兴试剂有限公司，中国)，OCT组织包埋剂(Lecia，德国)，异氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司，中国)，无水乙醇(辽宁新兴试剂有限公司，中国)，浸蜡脱蜡透明剂 (南昌雨露实验器材有限公司，中国)，中性树胶 (中国上海标本模型厂，中国)，DAB试剂盒 (福州迈新生物科技开发有限公司，中国)，DAB染色液(罗氏诊断产品有限公司，美国)，抗小鼠IL-1beta抗体(Servicebio，中国)，抗小鼠IL-6抗体(Servicebio，中国)，抗小鼠IL-23抗体(Bioss，中国)，抗小鼠IL-17A抗体(Servicebio，中国)，免疫组化二抗试剂盒，10%山羊血清封闭液，抗体液稀释液及50×柠檬酸钠抗原修复液(北京索莱宝生物科技有限公司，中国)。

1.3 方法

1.3.1 组织学观察 根据基因类型及处理条件，小鼠随机分为4组，包括WT对照组(WT-Blank)、MMP-13lox/lox对照组(MMP-13lox/lox-Blank)、咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)诱导的WT实验组(WT-IMQ)、IMQ诱导的MMP-13lox/lox实验组(MMP-13lox/lox-IMQ)，每组3只小鼠。小鼠造模实验重复两次，共计36只小鼠。小鼠自由饮食喂养，鼠房保持干燥、通风，室温21～26℃，湿度30%～50%。依据随机数字表对小鼠进行随机分组，正式实验前两天，剃除小鼠背部2 cm×3 cm区域毛发。实验组小鼠给予5%的IMQ乳膏62.5 mg/只，均匀涂抹在小鼠背部裸露区域。背部连续涂抹IMQ乳膏6天。对照组小鼠给予同等剂量凡士林，余处理过程同上。每日观察背部红斑、鳞屑及皮损增厚情况。给药第7天处死小鼠后取背部皮损组织，固定、脱水、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色后光镜下观察组织学改变。

1.3.2 大体观察 依据小鼠背部红斑、鳞屑、皮肤增厚等表现(0～4分)进行独立评分，评分规则如下：0=没有，1=轻度，2=中度，3=明显，4=非常明显；累积分数=(红斑+鳞屑+增厚，0～12分)用于表示皮肤炎症的程度。

1.3.3 免疫组化染色 将小鼠背部组织标本常规固定、脱钙、脱水、透明、石蜡包埋，制成6 μm厚切片，经烤片、脱蜡、梯度乙醇脱水、抗原修复后，分别滴入IL-6、IL-1β、IL-23一抗孵育过夜，第2天孵育二抗，经二氨基联苯胺显色后，再进行复染、盐酸分化，最后脱水、中性树胶封片。光镜下观察IL-6、IL-1β、IL-23、IL-17A表达情况并采集图像，用Image-Pro Plus 6.0对图像量化分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。正态分布数据用(均数±标准差)表示，独立样本t检验用于比较两组间的差异。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 小鼠皮损临床表现和PASI评分 应用咪喹莫特乳膏的第2天，WT小鼠的背部开始出现红斑及少量鳞屑，用药后3～5天，红斑加重，皮肤明显增厚，鳞屑增多。与WT小鼠相比，MMP-13LOX/LOX小鼠背部红斑略淡，鳞屑及皮肤增厚情况轻于WT组，给药后第3天达高峰，皮损表现相对温和。MMP-13LOX/LOX小鼠背部皮损在给药后第6天轻于WT小鼠，见图1。

IMQ诱导的WT小鼠皮损PASI评分显示，用药第2天小鼠背部皮肤即出现红斑、增厚和鳞屑，第3天红斑表现达高峰。鳞屑及皮肤厚度持续加重，第4天最为显著(呈典型的银屑病样改变)。MMP-13LOX/LOX小鼠的PASI评分显示，用药第2天小鼠背部皮肤即出现红斑、增厚和鳞屑。红斑在给药后第4天呈下降趋势，鳞屑及皮肤肥厚在给药后第三天达高峰，之后趋于平稳。IMQ诱导的两组，累积PASI评分显示MMP-13LOX/LOX小鼠的皮损评分低于WT小鼠(图2)。外用凡士林的对照组小鼠，包括MMP-13LOX/LOX和WT，整个实验期间背部皮肤未出现肉眼可见的炎症改变，其PASI评分趋近于0分。

WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：树突细胞特异性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：对照组小鼠

2.2 组织病理学 HE染色观察凡士林组(WT组及MMP-13LOX/LOX组)小鼠皮肤结构正常。与WT对照组小鼠相比，IMQ诱导的银屑病样小鼠表皮棘层肥厚、表皮突延长，真皮细胞浸润，海绵水肿。在IMQ诱导的银屑病样模型中，MMP-13LOX/LOX小鼠和WT小鼠棘层厚度分别为(374.40±76.50)μm和(581.74±78.72)μm，差异具有显著性(独立样本t检验，t=3.272，P=0.031，图3)。

与WT小鼠相比，MMP-13LOX/LOX小鼠真皮浸润细胞较少。 统计学分析显示，IMQ诱导后WT实验组小鼠和MMP-13LOX/LOX实验组小鼠的真皮细胞数分别为(41.67±9.02)个/视野和(34.67±6.66)个/视野，两者之间无显著性差异(独立样本t检验，t=1.082，P=0.34，图4)。

2.3 免疫组化 免疫组化结果显示，在银屑病样小鼠模型中，IL-6蛋白在WT小鼠皮损中的表达量明显高于MMP-13LOX/LOX小鼠，差异具有显著性(独立样本t检验，t=8.116，P=0.001，图5)。

与MMP-13LOX/LOX小鼠相比，WT小鼠皮损中IL-1β表达水平显著升高，差异具有显著性(独立样本t检验，t=2.916，P=0.043，图6)。

与MMP-13LOX/LOX小鼠相比，WT小鼠皮损中IL-23表达水平略升高，无显著性差异(独立样本t检验，t=1.193，P=0.299，图7)。

与MMP-13LOX/LOX小鼠相比，WT小鼠皮损中IL-17A表达水平略升高，无显著性差异(独立样本t检验，t=0.422，P=0.695，图8)。

2a:红斑评分(0～4分);2b:鳞屑评分(0～4分);2c:皮损厚度评分(0～4分);2d:总计分数(0～12分);*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：树突细胞特异性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：对照组小鼠

图3 银屑病样小鼠模型中，MMP-13LOX/LOX小鼠和WT小鼠棘层厚度比较 *P<0.05； WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：树突细胞特异性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：对照组小鼠 图4 银屑病样小鼠模型中，MMP-13LOX/LOX小鼠和WT小鼠真皮浸润细胞数比较 ns：无显著性差异；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：树突细胞特异性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特

*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：树突细胞特异性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：对照组小鼠

*P<0.05； WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：树突细胞特异性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：对照组小鼠

ns：无显著性差异；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：树突细胞特异性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：对照组小鼠

ns：无显著性差异；WT：野生型小鼠; MMP-13LOX/LOX：树突细胞特异性敲除MMP-13基因小鼠; IMQ：咪喹莫特; BLANK：对照组小鼠

3 讨论

树突状细胞是天然免疫和适应性免疫的专职抗原呈递细胞。在生命周期中，DC前体迁移到组织中，作为前哨细胞抵御入侵者，在摄取抗原并处理后，DC迁移到淋巴结，激活T淋巴细胞。DC可表达基质金属蛋白酶，DC或MMPs的失调在多种疾病中都有报道，如移植功能障碍和炎症性疾病等。对DC细胞中MMPs调控的深入研究，将有助于靶向调控DC，改善疾病[3,9,10]。MMP-13特殊的研究意义在于MMP-13存在特异性小分子抑制剂，与其他广泛表达于所有白细胞亚群的MMP-2和-9相比，MMP-13具有更强的DC限制性表达模式。因此，抑制MMP-13可以更精确地靶向调控DC，而不影响其他免疫过程。小鼠体外细胞学研究发现，MMP-13可调节DC的多种功能，包括激活CD8+T细胞，参与MHC-I表面表达，同时，在DC细胞MMP-13表达受抑制时，其分泌的细胞因子IL-12p70、IL-23p19、IL-6减少[3]。有研究发现，银屑病患者血清中及皮损处MMP-13表达升高[11]，也有研究报道，在小鼠银屑病样模型中MMP-13表达上调，提示MMP-13可能参与银屑病的发生[12]。为进一步探索DC细胞表达的MMP-13在银屑病发病机制中的作用，本研究构建有效的MMP-13LOX/LOX小鼠动物模型具有重要意义。

本文采用局部皮肤涂抹5%咪喹莫特乳膏的方法诱导银屑病样皮损的发生，模拟人类银屑病的发病过程。建模结束后，首先通过肉眼观察小鼠不同组别皮肤红斑、鳞屑及皮肤增厚的情况，并对PASI评分进行分析，发现在IMQ诱导的银屑病样小鼠模型中，与WT小鼠相比，MMP-13LOX/LOX小鼠皮损表现温和，仅有轻度的棘层肥厚和真皮细胞浸润。表明MMP-13可能影响银屑病样皮炎的严重程度和病理表现。通过免疫组化研究发现，MMP-13影响银屑病相关细胞因子的表达，与WT小鼠相比，MMP-13LOX/LOX小鼠皮损中IL-1β、IL-6表达下调，而IL-23和IL-17A表达无明显改变。

许多研究发现，IL-6是银屑病细胞因子网络中的关键成分，参与银屑病的发病，与银屑病的严重程度相关[13]。IL-6是一种重要的炎症介质，是辅助性T细胞Th1型细胞因子的重要组成成分，具有促炎和抗炎双重作用，能通过对内皮细胞的影响参与炎症反应，也可参与角质形成细胞及T细胞增殖和活化[14]。研究发现，银屑病患者IL-6主要是由DC和内皮细胞产生，银屑病皮损中IL-6表达增强。IL-6可促进STAT3的磷酸化过程，并抑制人体调节性T细胞，参与银屑病发生和发展[15]。

本研究发现，MMP-13LOX/LOX小鼠皮损中IL-6的表达下调与体外小鼠细胞在DC细胞MMP-13表达受抑制时研究结果一致，提示MMP-13可能通过影响IL-6的表达影响银屑病的炎症程度。

有研究报道表皮IL-1系统的调节紊乱与银屑病皮损的形成密切相关[16]。IL-lβ不仅参与炎症反应，而且还可诱导多种细胞产生淋巴因子。Barnawi等[17]研究发现银屑病患者血清中IL-1β水平高于正常对照组，临床症状好转前后IL-1β水平随有效治疗降低，提示IL-1β与银屑病的发病有一定关系。刘玮等[18]研究发现IL-1β参与了银屑病的皮损形成。孔一真等[19]研究发现，IL-1β在银屑病的发生发展过程中起重要作用，且与皮损严重程度相关。本研究对IMQ小鼠皮损处IL-1β的表达进行研究发现，MMP-13LOX/LOX小鼠皮损中IL-1β的表达下调，提示DC细胞的MMP-13可能通过影响IL-6的表达影响银屑病的炎症程度。

IL-23主要由抗原递呈细胞分泌。研究显示，银屑病患者皮损组织中DC、单个核细胞所分泌的IL-23表达水平增强[20]。寻常型银屑病患者血清中IL-23表达水平高于正常对照组，表明IL-23的高表达为银屑病患者免疫异常表现之一。同时，IL-23能刺激辅助T细胞分泌IL-17和IL-22，对真皮的炎症和表皮的增生有促进作用[21]。尽管体外小鼠细胞学研究发现DC细胞MMP-13表达受抑制时，其分泌的细胞因子IL-23p1减少，但本文通过检测DC细胞敲除MMP-13小鼠银屑病模型中皮损处IL-23和IL-17A的表达，未见明显差异，其原因有待进一步研究。

综上，我们通过构建特异性敲除DC细胞MMP-13基因的MMP-13LOX/LOX小鼠，应用咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型，发现DC细胞敲除MMP-13小鼠银屑病样模型中皮损处IL-6及IL-1β的表达下调，表明DC表达的MMP-13参与银屑病炎症因子IL-6及IL-1β的表达，提示DC细胞表达的MMP-13可能通过影响炎症因子的表达参与银屑病的发病，但其机制需进一步深入研究。