利用优化DNA质粒制备大鼠CD138单克隆抗体

罗芳芳，钱峰，梅芹

（1.上海药明生物技术有限公司，上海 200131；2.复旦大学 生命科学学院，上海 200438）

DNA免疫于1990年由Wolff等人首次发现，将编码蛋白的DNA质粒注射入小鼠骨骼肌内[1]，在肌肉细胞内表达基因产物蛋白质，从而奠定了DNA免疫的基础。通过DNA免疫技术，目的基因在体内合成蛋白质抗原，刺激机体产生特异性免疫反应[2]，获得高亲和力抗体。因此DNA免疫技术应用范围从疫苗研究、医学免疫学研究扩展至单克隆抗体药物研发。

虽然DNA免疫有多方面的优势，但免疫原性弱，免疫周期较长，因此提高其免疫原性是制备杂交瘤单克隆抗体的关键因素。

本研究选择大鼠CD138作为测试蛋白，在血液细胞中，CD138分子是浆细胞表面特异性标志[3-4]。传统杂交瘤单克隆抗体是由淋巴、脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合产生的，但淋巴、脾脏细胞成分复杂、细胞量大，而浆细胞含量仅占1%～5%[5]，所以特异性CD138抗体对评估淋巴和脾脏细胞中浆细胞含量特别重要。但尚无市售的抗大鼠CD138特异性单克隆抗体，而CD138大小鼠种属同源性高达90.4%，免疫原性低、动物免疫反应较弱。

DNA免疫效果是由质粒本身、抗原基因、分子佐剂、递送方式等因素相互作用所决定。本研究通过对DNA质粒转录后调控元件和分子佐剂进行优化增强DNA免疫反应。通过将luciferase和大鼠CD138基 因 克 隆 入 pCAGGS-HPRE、pCAGGS-WPRE、pCAGGS-HTLV-1R和pCAGGS-FliC载体，构建重组质粒。通过细胞瞬时转染表达系统、小鼠动物模型对目的基因体外表达水平、抗原特异性免疫反应进行系统比较。

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白作为一种新型免疫佐剂，其佐剂效应受到科学家的广泛关注。目前，关于FliC佐剂研究主要是通过细菌表达鞭毛蛋白。本研究将鼠沙门菌鞭毛蛋白克隆入pCAGGS表达载体进行抗原融合表达，利用鞭毛蛋白的佐剂效应增强DNA免疫原性，从而诱导更强的特异性免疫反应。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：BALB/C小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

质粒：pCAGGS、pNL3.2.NF-κB-RE[NlucP]由本实验室保存。

分子实验试剂：PrimeSTAR Max Premix(2x) DNA聚合酶和DNA分子量Marker购于Takara Bio公司；限制性内切酶购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司。T4 DNA连接酶购于新英格兰生物实验室（英国）有限公司；重组克隆试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；琼脂糖购于美国英杰生命技术有限公司；DNA回收试剂盒、质粒中抽和大抽试剂盒购于德国Macherey Nagel公司；无内毒素质粒小提中量试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。

菌株和细胞系：F-TOP10感受态细胞购于上海唯地生物技术有限公司；293F细胞由本实验室保存。

一抗和二抗：小鼠抗大鼠CD138血清由本实验室制备并保存，兔抗大鼠CD138多克隆抗体购于北京义翘神州科技股份有限公司。HRP标记羊抗小鼠IgG二抗购于BD公司，PE标记羊抗兔IgG购于艾博抗（上海）贸易有限公司，Alexae647标记羊抗小鼠IgG购于Bethyl Laboratories。

1.2 目的基因扩增

1.2.1 Luciferase和大鼠CD138基因PCR扩增

以 pNL3.2.NF-κB-RE[NlucP]质 粒 为 模 板，luc-F、luc-R为引物，PCR扩增出luciferase基因片段。以合成的大鼠CD138基因为模板，CD138-F、CD138-R为引物，PCR扩增出大鼠CD138基因片段。

1.2.2 4个元件PCR扩增

以合成的基因为模板，利用各自引物分别PCR扩增出WPER、HPRE、HTLV-1R & FliC DNA片段。

1.3 载体的构建及鉴定

1.3.1 各元件载体构建及鉴定

用XhoⅠ、NheⅠ酶切WPRE和HPRE PCR扩增片段、用EcolRⅠ、NotⅠ酶切HTLV-1R PCR扩增片段、用XhoⅠ、BglⅡ酶切FliC PCR扩增片段，分别克隆入pCAGGS质粒中。将转化菌种送到铂尚生物技术(上海)有限公司测序验证，并酶切验证。

五是做好流域水功能区纳污红线考核支撑。从2014年开始，国家对重要水功能区进行考核。长江流域水资源保护局负责组织流域水功能区考核的技术工作，组织制定流域水功能区水质达标评价技术细则，每年与地方协调制定年度水功能区考核名录和监测方案，并对各省区监测的水功能区评价结果进行复核，形成复核报告上报水利部。在最严格水资源管理制度考核中，长江流域水资源保护局也按照国务院考核组的统一部署，参与部分省区的考核，并提供长江流域的水功能区考核基础信息，有力的支撑了流域水功能区纳污红线考核工作[7]。

1.3.2 大鼠CD138和Luciferase表达载体构建及鉴定

大鼠CD138和Luciferase DNA片段通过PCR扩增，两端分别引入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点。酶切后将其克隆入pCAGGS、pCAGGS-WPRE、pCAGGSHPRE、pCAGGS-HTLV-1R和pCAGGS-FliC，构建重组质粒 pCD138、pWCD138、pHCD138、pHTCD138、pFCD138、pluc、pWluc、pHluc、pHTluc。将转化菌种送到铂尚生物技术(上海)有限公司测序验证，并用NotⅠ和XhoⅠ分别酶切验证重组质粒。

1.4 Luciferase和大鼠CD138基因瞬转表达检测

用Lipofectamine2000转染试剂对pCD138、pWCD138、pHCD138、pHTCD138、pFCD138、pluc、pWluc、pHluc、pHTluc质粒进行细胞瞬时转染表达，设置2个重复孔，未转染293F细胞为阴性对照。在37 ℃、5% CO2和200 r/min振荡速度条件下培养转染细胞，48 h后检测大鼠CD138和luciferase表达水平。

1.5 BALB/C小鼠DNA免疫

用 3个 DNA质 粒（pCD138、pHCD138、pFCD138）分别免疫BALB/C小鼠，其中pCD138为对照组，pHCD138和pFCD138为实验组，每组4只小鼠。免疫剂量：200 μg/只，免疫途径：肌肉和皮下注射，每两周免疫一次。

1.6 抗大鼠CD138抗体血清效价检测

用0.5 μg/mL大鼠CD138蛋白包被酶标板，4 ℃过夜。PBST洗涤1次，2%BSA孵育2 h，PBST洗涤3次。小鼠血清以1∶100为起始浓度进行3倍稀释，共11个稀释度。将稀释小鼠血清加入ELISA酶标板中，室温孵育1 h。PBST洗涤3次，加入HPR标记羊抗小鼠抗体，室温孵育1 h。TMB显色10 min，HCl终止反应。酶标仪测定OD450值。

1.7 抗大鼠CD138杂交瘤单克隆抗体制备与筛选

从pFCD138质粒组和对照组中分别选取一只高抗体效价BALB/C小鼠，用于杂交瘤单克隆抗体制备。按照标准的细胞电融合操作程序处理淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞进行电融合。在HAT筛选培养基中培养融合杂交瘤细胞，在37 ℃和5% CO2下进行定期监测。培养7～10 d后，用ELISA和FACS方法鉴定阳性杂交瘤细胞。经亚克隆后，筛选出能够稳定分泌抗体的杂交瘤单克隆细胞。培养7～10 d，收获细胞上清液，用Protein A进行抗体亲和力纯化，并评估抗体特异性。

1.8 抗大鼠CD138单克隆抗体特异性检测

抗大鼠CD138抗体以10 μg/mL为起始浓度进行5倍稀释，共12个稀释度，用抗大鼠CD138抗体血清效价相同的方法进行ELISA检测。

2 结果与分析

2.1 目的基因和各元件的PCR扩增

以质粒pNL3.2.NF-κB-RE[NlucP]为模板，PCR扩增出luciferase基因，获得639 bp DNA片段（图1）。以合成的大鼠CD138基因为模板，PCR扩增出大鼠CD138基因，获得942 bp片段（图2）。

以合成的基因为模板，PCR方法扩增WPRE、HPRE、HTLV-1R、FliC基因，分别得到598 bp、542 bp、227 bp、1 485 bp DNA片段（图3）。

图1 Luciferase PCR扩增

图2 Rat CD138 PCR扩增

2.2 质粒载体酶切验证

图3 各个元件扩增

Luciferase和大鼠CD138基因片段分别为663 bp和 942 bp，pCD138、pWCD138、pHCD138、pHTCD138、pFCD138、pluc、pWluc、pHluc、pHTluc、pFluc重组表达质粒分别经NotⅠ、XhoⅠ酶切验证（图4）和测序验证均完全正确。

WPRE、HPRE、HTLV-1R和Flic基因片段分别为598 bp、574 bp、227 bp和1 485 bp，构建的重组质粒经XhoⅠ和NheⅠ酶切验证和测序验证均完全正确。

图4 载体经NotⅠ和XhoⅠ酶切鉴定

2.3 大鼠CD138和luciferase基因瞬转表达分析

如图5 Luciferase瞬时转染表达结果表明：pluc质粒为对照组，其Luciferase平均活性为789250 RLU。与对照组相比，含HPRE元件pHluc质粒显著地提高Luciferase表达水平（P＜0.05）；pWluc、pHTluc质粒luciferase表达水平无显著差异（P＞0.05）。

图5 3个转录后调节元件对luciferase表达水平的影响

如图6大鼠CD138瞬时转染表达检测结果表明：与对照组pCD138质粒相比，含HPRE元件pHCD138质粒大鼠CD138表达水平相似，无显著差异（P＞0.05）；pWCD138、pHTCD138质粒大鼠CD138表达降低，但无显著差异（P＞0.05）；pFCD138质粒大鼠CD138表达水平显著降低（P＜0.05）。

2.4 抗大鼠CD138特异性血清效价检测

如图7小鼠血清效价结果表明：与对照组（pCD138）相比，pFCD138质粒明显提高 BALB/C小鼠的动物免疫反应，其他质粒相对较弱；而且pFCD138质粒组动物免疫反应更快，明显缩短免疫周期。

图6 4个元件对大鼠CD138表达的影响

图7 大鼠CD138特异性血清效价总结

2.5 抗大鼠CD138杂交瘤单克隆抗体制备与筛选

用ELISA和FACS方法鉴定阳性杂交瘤细胞，获得5株阳性杂交瘤细胞：1株阳性杂交瘤细胞（clone 8-C2）来自对照组质粒，4株阳性杂交瘤细胞（clone 35-G11、39-D2、42-G8和 44-A9） 来 自 pFCD138质粒组。经过亚克隆，最终获得4个阳性杂交瘤单克隆细胞（clone 8-C2、35-G11、39-D2和44-A9）。

2.6 抗大鼠CD138纯化单克隆抗体评估与鉴定

图8所示，从pFCD138质粒获得35-G11和39-D2两株单克隆抗体均与大鼠CD138特异性结合，而且具有高亲和力。35-G11抗体ELISA EC50 0.03 μg/mL，FACS EC50 0.33 μg/mL；39-D2 抗 体ELISA EC50 0.03 μg/mL，FACS EC50 0.39 μg/mL。但8-C2和44-A9抗体与大鼠CD138结合力弱，均无法计算EC50。其中8-C2抗体来自pCD138质粒免疫、44-A9抗体来自pFCD138质粒免疫。

鞭毛蛋白FliC作为一种新型分子佐剂，通过TLR5介导多种信号通路的免疫刺激反应。鞭毛蛋白以多种形式佐剂诱导强烈先天性免疫和适应性免疫反应，因此鞭毛蛋白具有非常广泛的适应性[7]。鞭毛蛋白作为免疫佐剂具有很多优越性：（1）鞭毛蛋白对宿主不会产生超敏反应；（2）活化抗原呈递细胞的功能显著，且可同时增强抗原呈递细胞对外来抗原的摄取、加工和递呈功能。本研究表明将鞭毛蛋白克隆入哺乳动物表达载体，与抗原基因融合表达，不仅显著增强小鼠特异性免疫反应，而且获得更多高质量的特异性抗体。

3 结论

HPRE质粒能显著增强luciferase表达水平，WPRE、HTLV-1R元件对目的基因表达无增强作用。FliC质粒会降低大鼠CD138表达，与预期结果相符。因为FliC作为免疫佐剂，并不具有调控基因表达的作用，但与抗原基因融合表达，大分子量蛋白质会影响其表达量。最终选择HPRE元件及FliC质粒进行小鼠免疫反应效果评价。FliC质粒显著提高 BALB/C小鼠免疫反应，而且动物免疫反应更快，明显缩短免疫周期。HPRE反而会降低动物免疫反应，可能是HPRE与pCAGGS质粒AG内含子并没有协同作用。FliC作为新型分子佐剂，与抗原基因融合表达，能共同激活抗原呈递细胞，促进抗原在细胞内提呈、加工，诱导促炎症性因子以及细胞因子的分泌，从而激活T细胞和B细胞应答。与对照组（pCD138质粒）相比，含FliC质粒获得35-G11和39-D2杂交瘤单克隆抗体具有更高的亲和力。

图8 大鼠CD138抗体特异性结合鉴定