基于甲型H1N1流感病毒聚合酶链反应检测的实验室生物安全风险点分析

胡凯，马宏，王莉，赵二江，贾松树，郭永军

(1.河南省医学科学院，河南 郑州 450046；2.河南省疾病预防控制中心，河南 郑州 450000；3.郑州大学附属肿瘤医院，河南 郑州 450003)

2009年3月墨西哥和美国等先后爆发了甲型H1N1流感，为A型流感病毒，H1N1亚型流感病毒毒株，该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感3种流感病毒的基因片段，是一种新型流感病毒，可以人传染人，随后在全球蔓延[1-2]。中国首例甲型H1N1流感病例2009年5月发生在四川省，随即在全国范围内引起流感大流行[3]。甲型流感病毒表面血凝素是该病毒主要抗原，具有免疫原性，能使人体产生保护性抗体，但易发生变异，从而导致该病毒在人群中暴发流行[4]。为保障实验室在进行甲型H1N1流感病毒核酸检测时的生物安全，最大限度地减轻对实验室人员和环境造成的危害和损失，本文拟明确实验室采用实时荧光逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测甲型H1N1流感病毒过程中的风险点，并提出降低风险的具体措施。

1 甲型H1N1流感病毒生物学特性

1.1 病原学特点甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科，甲型流感病毒属。典型病毒颗粒呈球状，直径为80～120 nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是红细胞血凝素、神经氨酸酶和基质蛋白M2。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10 nm[2]。在MDCK细胞系中可进行病毒的分离培养。

1.2 病原学稳定性甲型H1N1流感病毒对乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒剂敏感，对热敏感，56 ℃条件下30 min可灭活[2]。实验室高压蒸汽灭菌器可以有效灭活病毒，使用条件可以设定为121 ℃，0.1 MPa，20 min；对大多数化学消毒剂敏感，如乙醚、体积分数为75%的乙醇、含氯消毒剂(二氧化氯500 g·L-1、含氯消毒剂1 000 g·L-1，作用30 min)、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒，但氯已定不能有效灭活病毒。

2 风险点的确定

2.1 确定方法根据中国疾病预防控制中心制订的《突发事件公共卫生风险评估技术方案(试行)》[5]，同时参考澳大利亚和新西兰制订的《风险管理标准》AS/NZS 4360—2004[6]，运用文献法、专家会商法明确实时荧光RT-PCR技术在甲型H1N1流感病毒实验室检测过程中的生物安全风险点[7]。

2.2 专家选取选取有传染病学、医学检验、流行病学、院感和实验室生物安全管理等专业背景的10名专家，分别来自省、市级疾控机构、省级医疗机构、省级采供血机构、科研机构和高等院校。其中省级疾控机构3名，市级疾控机构1名，省级医疗机构2名，省级采供血机构1名，科研机构2名，高等院校1名。

2.3 信息收集收集甲型H1N1流感病毒相关信息，包括世界卫生组织、国家卫生健康委、中国疾病预防控制中心发布的关于甲型H1N1流感信息、文献信息和媒体报道信息等。

3 实验活动程序

依据《甲型H1N1流感诊疗方案(2010年版)要求[2]，采用实时荧光RT-PCR技术检测疑似H1N1流感病毒患者的咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物、痰中甲型H1N1流感病毒核酸。实验活动程序主要包括收取标本、标本处理、提取病毒模板、RT-PCR扩增、实验废弃物处理及清场。

4 生物安全风险点

4.1 实验活动风险点包括2项：(1)在收集标本和运送过程中，存在标本管破碎、运送箱被污染的可能；(2)标本震荡、离心、提取核酸时发生试管破裂、甩出、管帽脱落、弹开、跌落等情况，感染性物质溅出，产生气溶胶。

4.2 实验室围护结构和设备风险点包括3项：(1)标本制备间负压异常或形成正压造成人员或气溶胶外溢，缓冲间互锁装置失灵，造成人员被困；(2)生物安全柜故障，如出现断电、高效过滤器损坏导致的生物安全柜出现正压、气流紊乱、气溶胶泄露；(3)高压蒸汽灭菌器压力、温度出现偏差，造成实验室废弃物、患者标本消毒不彻底，压力过高发生爆炸，未充分冷却取物造成烫伤。

4.3 实验人员风险点包括4项：(1)技术操作程序不熟悉，出现加错试剂或标本、标本在生物安全柜内或外发生溢洒等；(2)生物安全意识不足，缺乏生物安全相关知识，无实验室良好实验行为；(3)身体状况欠佳，有基础疾病，具有发热、干咳、乏力等症状，可能发生实验室感染；(4)心理素质不佳，不适应实验室长时间的密闭环境操作。

4.4 临时进入实验室人员风险点包括1项：外来人员(如仪器设备维修维护人员、单位管理人员、辅助人员等)生物安全意识缺乏、未经过系统培训以及实验室基本技能欠缺。

4.5 个人防护装备风险点包括4项：(1)口罩类型不符合医用标准，密合性检测不合格，超过有效期，长时间佩戴，受到体液或其他液体喷溅；(2)防护服不符合国家标准，防护服破损、撕裂，防护服受到感染性物质喷溅，穿脱防护服顺序错误；(3)乳胶手套佩戴错误；(4)护目镜使用错误。

4.6 清场及消毒风险点包括2项：(1)消毒剂种类不正确，消毒方式不规范；(2)实验耗材及实验固废、废液处理不规范。

4.7 意外事件及处理风险点包括2项：(1)利器刺破皮肤；(2)实验室水、电、燃气使用中所发生的风险。

5 降低生物安全风险的措施

5.1 规范实验活动操作严格使用有效氯消毒液对样本容器进行消毒，转移试管时，动作应轻柔，用试管架或方盒盛装，移至生物安全柜内进行相应实验操作。在生物安全柜内使用小型振荡器，震荡前拧紧管帽，固定好试管。使用带密封盖的生物安全型离心机，发生意外后，不打开离心转头盖，将转头整体卸下，移至生物安全柜中打开转头盖。标本开盖时工作台面应放置1块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸。

5.2 加强实验室围护结构和设备的维护及状态确认实验室应根据甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测特点建立围护结构状态确认程序和涉及生物安全重要设施设备的维护方案及操作规程，明确紧急状态下意外事件的处置原则。对于实验室压力控制系统要定期进行维护，每次开启系统均需检查气压，要确保实验室缓冲间和工作区维持正常梯度压力。生物安全柜安装位置应符合相关标准要求，定期由有资质的第三方进行维护性检验[8]，每次开机用丝线法初步检查安全柜压力正常后，方可开展实验活动。每次离心时应检查离心机密封状态，应建立离心意外事件处置程序。加强高压蒸汽灭菌器状态核查[9]，制定高压蒸汽灭菌器标准操作程序，进行灭菌效果监测，并规范使用记录。

5.3 进一步促进实验人员生物安全意识和相关能力提升提升实验室操作人员的生物安全意识和操作技能是实验室生物安全管理的一项重要内容，应加强甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测实验室操作的基本技能、检测规程和流程、仪器设备使用等方面的培训[10]，并对培训效果进行考核和验证。掌握发生溢洒等突发生物安全事件的应急处理方法。实验操作人员应身体健康，无基础性疾病，心理素质稳定，能耐受在密闭环境下长时间工作。此外，实验人员需建立身体健康档案，预留本底血清，建立实验人员身体异常发现和报告制度。

5.4 严格管控临时进入实验室人员实验室应制定全面的管理程序，严格执行实验室人员准入制度。临时人员进入实验室必须有实验室负责人批准，进入人员需经过生物安全培训，并告知进入实验室可能出现的危害，签署知情同意书。同时需有2名工作人员陪同进入并及时提醒注意事项。临时进入人员进入时需与实验室工作人员按照同等防护水平穿戴防护装备。进入前要测量体温。临时人员工作完成后，实验室应详细记录其进入时间及其联系方式，并告知其在1个最长潜伏期内(14 d)密切关注自己是否出现相应的临床症状，如出现相应症状应立即报告相关部门，及时就医。

5.5 积极落实个人防护要求实验室应根据不同生物安全危害要求建立不同等级的个人防护装备使用和监督检查规范，由单位统一采购具有国家医疗器械注册证符合相关标准的个人防护用品。实验室内务人员应每周检查实验室内备存的个人防护用品的有效期，检查存货效期并对检查结果负责。一次性医用外科口罩只用于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)实验室试剂准备间和结果分析间，人员进入标本制备间应按照二级个人防护要求佩戴医用口罩。实验室工作人员佩戴口罩一般不超过4 h，如遇液体喷溅，需及时用安全的方式进行更换。实验室应备有一次性吸水材料和有效消毒剂，以备应急处理[11]。必要时应规范佩戴护目镜。

5.6 规范实验室清场及消毒实验室配备充足的空气消毒机或紫外线灯，实验前后常规消毒(空气消毒机每次使用1 h，紫外线灯每次使用30 min)；实验前后使用500 mg·L-1有效氯的消毒液(84消毒液稀释100倍)进行桌面、台面及地面消毒；所用门把手等公共设施每天使用500 mg·L-1有效氯的消毒液消毒3次；实验前后用体积分数为75%的酒精对生物安全柜进行擦拭；转运及存放标本的容器使用前后用体积分数为75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。所有标本需放置在专用密闭容器中转运，进行高压蒸汽灭菌处理后方可离开实验室。实验过程中如使用锐器(包括针头、小刀、金属和玻片等)要直接弃置于锐器盒内，高压蒸汽灭菌前对于固态废物可适当松开包装袋口以加强灭菌效果[12]。高压灭菌后固体废物用专用密闭容器进行包装、密封、贴标签，送到医疗废物暂存地，由有资质的医疗废物处置机构统一处理，液体废物高压灭菌调节液体pH值为中性后方可排出[10,13]。

5.7 制定预案，妥善处置生物安全风险在操作甲型H1N1流感病毒毒株或其他潜在感染性材料时要严格执行实验操作规程，加强个人防护，选择心理素质好、健康状态佳的人员进行实验操作，避免发生针刺事件。在实验室发生水、电、燃气故障，可能导致生物安全重大风险时，要制定紧急处置预案。对已发生的污染事件要立即采取消毒措施，污染生物安全柜的操作台造成局限感染时使用有效氯消毒液对工作台面进行消毒。含病毒的培养皿碎裂或倾覆造成实验室污染时，应保持实验室空间密闭，使用浸有有效氯消毒液的毛巾覆盖污染区进行消毒处理，大量溢洒时可用有效消毒剂采用熏蒸或气溶胶喷雾法对实验室进行整体消毒。