天麻中香草醇对灰树花菌丝体生物量和胞外多糖合成的影响

张宗启，吴天祥,2，*，刘力萍

(1.贵州大学 酿酒与食品工程学院， 贵州 贵阳 550025；2.贵州食品工程职业学院， 贵州 清镇 551400)

灰树花(Grifolafrondosa)是近几年开发出的一种药食兼用真菌，隶属于非褶菌目、多孔菌科、树花菌属，又名贝叶多孔菌、栗子蘑、莲花菌等。日本称之为“舞茸”(maitake)，美国称之为“林鸡”(hen of the woods)[1]。近几年研究表明，灰树花多糖作为一种有效的生物免疫调节剂，具有明显的抗肿瘤[2-3]、抗HIV病毒[4]、改善免疫系统功能[5]、治疗皮肤病[6]、清除自由基等生理功能[7-8]。天麻(Rhizomagastrodiae)作为贵州三宝之一，是我国记录最早和最重要的传统草药之一，其主要含有天麻素(gastrodiae，GA)、对羟基苯甲醛(p-hydroxylbenzaldehyde，HBA)、对羟基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol，HA)、香草醇(vanillyl alcohol，VA)和香草醛(vanillin，VL)等[9-10]。天麻及天麻提取物均可用于抗厥药、镇痛药及预防全身麻痹、癫痫、眩晕、破伤风等[11]，由于其显著的医疗效果，在许多国家被广泛作为保健品使用。

近年来，国内外不少研究表明外源添加物可以促进真菌细胞生长和代谢产物的生成。毕澎洋[12]研究发现薏苡仁油和薏苡仁酯添加到灵芝发酵体系中会影响灵芝胞外多糖的分泌及其胞外多糖组分种类，其中2%薏苡仁油可以促进灵芝胞内、胞外多糖产量及灵芝酸含量，灵芝酸含量最高为对照组的4.04倍；Kim等[13]利用中药牛蒡子提取物成分加入到灰树花液体培养体系中，发现灰树花发酵体系中的酶能将牛蒡子苷转化为苷元，且加入牛蒡子提取物的灰树花多糖有抗氧化活性；郑浩然等[14]在灵芝发酵体系中添加铁皮石斛，发现铁皮石斛能促进灵芝胞外多糖的合成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

对羟基苯甲醛、香草醇，美国Sigma公司；葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、无水乙醇，北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BXM- 30R型立式灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TS- 2102C型恒温振荡器，上海天呈实验仪器制造有限公司；TDL- 40B型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；SW- CJ- 1D型净化工作台，苏州净化设备有限公司；UV- 1800型双光速紫外可见光光度计，上海欣茂仪器有限公司；Agilent 1100型高效液相色谱仪及检测器、Agilent 5TC- C18色谱柱，美国Agilent公司。

1.3 培养方法

1.3.1灰树花培养基配制

斜面种子培养基(PDA培养基，g/L)：马铃薯(去皮)200、葡萄糖20、蛋白胨2、KH2PO42、MgSO4·7H2O 1、琼脂20，自然pH值。

液体种子培养基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨2、KH2PO40.5、MgSO4·7H2O 0.5、酵母膏6，自然pH值。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖50、蛋白胨5、KH2PO42、MgSO4·7H2O 2、酵母膏10，自然pH值。

1.3.2灰树花培养

1)斜面种子培养。从长满灰树花菌丝体的母种试管中用接种铲取黄豆粒大小的菌丝块，接种于PDA培养基试管中部，放置于25 ℃恒温培养箱，至菌丝体长满整个斜面后，转存于4 ℃条件下保藏使用。

2)液体种子培养。用接种勺取1勺长满整个斜面的斜面种子培养基中的菌丝体，接种于液体种子培养基中。250 mL锥形瓶中装液量为100 mL，放入转子后于旋涡震荡机中震荡5 min，将菌丝体打碎后于25 ℃、1 500 r/min摇床中培养7 d。

3)发酵培养。在无菌操作条件下，按10%的接种量，移液枪吸取10 mL液体种子培养基于发酵培养基中，250 mL锥形瓶中装液量为100 mL，25 ℃、150 r/min培养12 d左右，至菌液中出现大量大小均匀的菌丝体球且菌液清亮。

1.4 天麻醇提物制备

天麻粉末制备：将新鲜天麻清洗干净，去除泥土，切碎，60 ℃烘干粉碎后，过80目筛备用。

准确称取20 g天麻粉末，加入200 mL体积分数为75%的无水乙醇，25 ℃条件下浸提48 h，过滤，旋转蒸发除去乙醇，再加入200 mL蒸馏水重溶，即1 g天麻可得10 mL的醇提物，用于灰树花液体发酵培养。

1.5 检测方法

1.5.1生物量测定

灰树花菌体生长情况以其菌丝体生物量为指标进行测定。将发酵培养基中菌丝体经8层纱布过滤，蒸馏水冲洗菌丝体3次后，于70 ℃数显恒温干燥箱中干燥，直至菌丝体恒重，记录所得菌丝体质量。

1.5.2胞外多糖产量测定

灰树花发酵体系中胞外多糖产量采用苯酚- 硫酸法进行测定[19]。发酵液超滤(截留量10 kDa)后旋转浓缩至原体积的四分之一，再经透析(截留量7 000 Da)后，取适量发酵液于离心管内，加入4倍体积95%(体积分数)无水乙醇，于4 ℃条件下醇沉24 h后，6 000 r/min离心15 min，倾去上清液，沉淀加蒸馏水重溶，待测。

1.5.3香草醇含量测定

香草醇含量测定采用高效液相色谱法[20]。称取香草醇3 mg，加入30 mL纯净水溶解，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的标准品溶液，待测。取1.5 mL发酵液过0.22 μm滤膜，待测。

检测条件：色谱柱为Agilent TC- C18(4.6 mm×250 mm，10 μm)；流动相为0.1%磷酸水(流动相A)和乙腈(流动相B)；梯度洗脱为0～35 min，体积分数3%～30%乙腈；35～45 min, 体积分数30%～70%乙腈；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长221 nm。

1.6 数据处理

实验数据采用Origin 9.0软件绘图，SPSS 19.0软件分析显著性，显著性检验采用最小显著差数法。

2 结果与分析

2.1 天麻醇提物成分分析

课题组前期研究表明，天麻醇提物灭菌前后的主要成分含量会发生改变，尤其是天麻素同巴利森苷之间的转化，巴利森苷是由3个天麻素分子和1个柠檬酸分子连接而成[21]。选择灭菌后的天麻醇提物进行香草醇含量测定实验，测定结果如图1。由图1可知，天麻醇提物除了含有GA、HBA及HA以外，香草醇也是天麻醇提物的主要成分，出峰时间为14 min，经计算得灭菌后的7%天麻醇提物中香草醇含量为0.43 mg/g。

图1 天麻醇提物和香草醇标准品的HPLC分析Fig.1 Analysis of R. gastrodiae alcohol extract and vanillyl alcohol standard by HPLC

2.2 香草醇对菌丝体生物量和EPS产量的影响

为了分析香草醇对灰树花菌丝体生物量及EPS产量的影响及最佳添加量，在灰树花深层发酵体系中加入0～300 mg/L的香草醇，发酵12 d后灰树花菌丝体生物量及EPS产量的变化如图2。由图2可知，随着香草醇质量浓度的增加，生物量与EPS产量均呈现出一定的先升高后降低的趋势。这说明一定量的香草醇可以刺激深层发酵的灰树花菌体，有利于菌丝体的生长和胞外多糖的分泌；但质量浓度过高会抑制菌丝体的生长，从而使得胞外多糖产量降低。当香草醇质量浓度为200 mg/L时，灰树花菌丝体生物量与EPS产量均达到最大值，分别为(1.47±0.02) g/L和(2.21±0.03) g/L，相较于空白组分别提高了21.1%和19.9%，且差异显著(P<0.05)，故200 mg/L的香草醇为较佳添加量。

图2 香草醇添加量对灰树花菌丝体生物量 和EPS产量的影响Fig.2 Effect of vanillyl alcohol concentration on mycelial biomass and EPS production by submerged culture of G. frondosa

2.3 香草醇对发酵过程中菌丝体生物量和EPS产量的影响

将200 mg/L的香草醇和7%的天麻醇提物添加到灰树花液体培养基中进行实验，空白组中不加入任何外源添加物，测定天数为16 d，分析香草醇和天麻醇提物对灰树花发酵过程中菌丝体生物量和EPS产量的促进作用，结果如图3。在整个发酵过程中，生物量和EPS产量均呈先上升后趋近于平缓的趋势。在发酵的前4 d，灰树花菌种处于迟滞期，菌丝体生物量和多糖产量均较低且增长较缓慢，实验组和空白组多糖产量增加趋势较为接近；在第5～12天，灰树花菌种处于对数生长期，菌丝体生物量和多糖产量呈明显的上升趋势，且香草醇实验组明显高于空白组，在这期间真菌灰树花大量利用发酵体系中营养物质，供自身生长和EPS的分泌；发酵第13～16天，菌株处于稳定期，此时菌丝体生物量和胞外多糖产量趋于稳定，其中第14天，香草醇和天麻醇提物实验组多糖合成量达到最大值，分别为(2.10±0.03) g/L和(2.39±0.03) g/L，均显著高于空白组(P<0.05)。此外，实验组在第14天后多糖增加较为平缓，这可能与生长环境和体系中营养物质的消耗有关。因此，培养最佳周期为14 d。本实验灰树花生物量和EPS产量变化趋势与Wang等[17]研究结果基本一致，说明香草醇可以显著地促进灰树花菌丝体生物量和EPS的产生。

图3 香草醇和天麻醇提物对灰树花发酵过程中生物量和EPS产量的影响Fig.3 Effect of vanillyl alcohol and R. gastrodiae alcohol extract on mycelial biomass and EPS production during G. frondosa fermentation

2.4 发酵过程中香草醇含量变化分析

灰树花深层发酵周期为14 d，选择发酵第0天和第14天的发酵液进行高效液相色谱检测，对比峰面积，推算发酵体系中香草醇含量的变化，从而确定灰树花对香草醇的利用率，峰面积和香草醇含量结果见图4和表1。结果表明，空白组(未添加天麻醇提物)没有检测到香草醇成分，而实验组(添加7%天麻醇提物)显示第0天和第14天的香草醇含量分别为0.41 mg/g和0.13 mg/g，降低了68.3%，这可能是香草醇作为含碳有机物被灰树花利用，也可能是灰树花体系中的酶将香草醇转化为其他易于自身吸收利用的物质。黄忠等[22]研究发现，在灰树花发酵周期中，天麻特征成分天麻素、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛均会发生含量的变化，其中天麻素含量降低了47.86%，对羟基苯加醇降低了11.84%，对羟基苯甲醛含量降低了74.64%；结合本实验发现，对羟基苯甲醛是灰树花能够最有效利用的物质，其次是香草醇、天麻素、对羟基苯甲醇。香草醇利用率的确定对天麻醇提物和天麻特征成分作用于灰树花深层发酵提供了新的理论依据。

图4 发酵第0天和第14天香草醇的HPLC分析Fig.4 Analysis of fermentation with vanillyl alcohol at 0th day and 14th day by HPLC

2.5 天麻醇提物、香草醇、对羟基苯甲醛对菌丝体生物量及EPS产量的影响分析

以200 mg/L香草醇为实验对象，同7%天麻醇提物组、150 mg/L对羟基苯甲醛组及空白组对比灰树花菌丝体生物量及EPS产量差异，结果如图5。天麻醇提物对菌丝体生物量及EPS产量影响最大，其次为对羟基苯甲醛和香草醇实验组，空白组最低。

表1 灰树花发酵过程中香草醇含量变化Tab.1 Changes of vanillyl alcohol content during G. frondosafermentation

香草醇组的生物量为(1.40±0.02) g/L，与天麻醇提物组(1.58±0.03) g/L和对羟基苯甲醛组(1.51±0.03) g/L比较，分别降低了11.4%和7.3%，但较空白组(1.19±0.05) g/L提高了17.6%且差异显著(P<0.05)；此外香草醇组胞外多糖产量为(2.28±0.02) g/L，同空白组(1.66±0.03) g/L相比，提高了37.3%且差异显著(P<0.05)。这与吴彩云等[16]关于对羟基苯甲醛和7%天麻醇提物对灰树花EPS生物合成促进作用的研究结果基本一致。因此，香草醇可以促进灰树花菌丝体生长和胞外多糖的合成，但促进效果略低于天麻醇提物和对羟基苯甲醛。

图5 天麻醇提物、香草醇和对羟基苯甲醛对灰树 花生物量和EPS产量的影响Fig.5 Effect of R. gastrodiae extract, vanillyl alcohol and HA on mycelial biomass and EPS production by G. frondosa

灰树花EPS合成与多糖合成酶作用相关，Vandamme等[23]及Wu等[24]研究表明：α-磷酸变位酶(α-phosphogluconate mutase,α-PGM)、磷酸葡萄糖异构酶(phosphogluconate isomerase, PGI)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶(dTDP-glucose pyrophosphorylase, AGPase)是灰树花多糖合成途径和糖酵解途径的关键酶，其中α-PGM和PGI是影响糖代谢进入多糖合成途径的关键酶，而UGPase和AGPase是影响灰树花多糖种类和单糖构成的关键酶；而Xu等[25]研究发现,天麻醇提物提高灰树花体系中α-PGM酶活性，降低PGI酶活力；Tang等[26]研究发现，多糖的合成与α-PGM和PGI密切相关，其中α-PGM酶活力的提高与EPS合成呈正相关，而PGI酶活力的提高与EPS合成呈负相关，PGI酶活力提高会减少糖异生途径(EPS合成途径)的碳通量，不利于EPS的合成。

3 结 论

探究天麻醇提物主要成分香草醇对灰树花深层发酵体系中菌丝体生物量及EPS产量的影响。通过高效液相色谱分析得出香草醇是天麻醇提物的主要成分，且灰树花EPS产量达到最佳的发酵时间为14 d；第14天与第0天相比，香草醇利用率为68.3%，显著高于对羟基苯甲醇和天麻素利用率，但低于对羟基苯甲醛的利用率。此外，当香草醇质量浓度为200 mg/L时，灰树花生物量和EPS的产量达到最大值,分别为(1.47±0.02) g/L和(2.21±0.03) g/L，与对照组比较，分别提高了21.1%和19.9%。故香草醇对灰树花生物量和EPS产量均有一定促进作用，但由于灰树花深层发酵的作用，香草醇的羟基是否转化为香草醛的羰基或其他物质，且香草醇对关键酶酶活力的影响同天麻醇提物相比是否存在显著差异需要进一步的研究。