解冻方式对冷冻泥鳅肌肉组织理化性质和微观结构的影响

郑 捷，徐婷婷，胡爱军，*，高建忠

(1.天津科技大学 食品科学与工程学院， 天津 300457；2.天津鸿腾水产科技发展有限公司， 天津 301800)

泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)属鲤形目，体形细长，在我国许多区域均有分布。泥鳅的营养丰富，含有人体所需的多种营养物质，如蛋白质、不饱和脂肪酸以及钠、钾等多种微量元素。泥鳅鱼肉脂肪和胆固醇含量低，肌肉中的必需氨基酸含量占总氨基酸的比例较高，其不饱和脂肪酸占总脂肪酸的含量超过了60%。泥鳅生活水温10～30 ℃，冬季水温下降到5 ℃以下时，会钻入泥中20～30 cm深处越冬。泥鳅在冬季不易捕捞，产量较少，而春秋两季气候适宜，适合泥鳅生长，产量较多，这使得泥鳅的产业化加工受到季节限制。

大多数鱼类产品多为冷冻运输，冷冻虽能延长货架期，但是水产品在冻藏中会发生损伤及蛋白质的冷冻变性[1]。鱼肉在解冻过程中会出现水分和营养物质损失、蛋白质析出、脂肪氧化等问题，选择合适的解冻方式能够有效降低其对鱼肉品质的不利影响。目前，常见的解冻方式有流水解冻、空气解冻、电场解冻等。关于冷冻和解冻对肌肉组织的物理和化学性质的影响研究大多数集中在深海鱼和畜肉(猪牛羊等)，对淡水鱼类的研究较少，解冻方式对泥鳅肌肉组织理化性质和微观结构的影响尚未见文献报导。

本实验比较了4 ℃解冻、室温解冻、流水解冻、微波解冻、超声解冻5种不同解冻方式对冷冻泥鳅品质和结构的影响，并结合低场核磁共振技术(LF-NMR)，研究解冻对泥鳅鱼肉水分分布的影响，最终确定一种较佳解冻方式，希望为泥鳅的解冻及加工提供理论和技术支持，并为相关水产品的解冻和加工技术提升提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泥鳅为天津市宝坻区鲜活黄坂泥鳅，质量为(42.0±2.7)g；碘化钾，天津风船化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，天津恒兴化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G250，上海迈瑞尔化学技术有限公司；牛血清蛋白，天津凯思博生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Alpha- 1502型紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司；PHS- 3BW型pH计，上海邦特仪器有限公司；G80F23CN3L- C2(B6)型微波炉，广东美的电器制造公司；TDZ5- WS型离心机，Thermo Fisher公司；FA2204B型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；AS- D型温度计，保德仪器具公司；SU1510型扫描电子显微镜，德国里奥公司；MicroMR型低场核磁共振仪，苏州纽迈分析仪器股份有限公司；HH- 4J型水浴锅，金坛市白塔新宝仪器厂。

1.3 冻结方式及前处理方法

将鲜活泥鳅宰杀后去除内脏，清洗干净用自封袋包装后放入-18 ℃的冰箱内冻结。冻结48 h后取出，解冻方式见表1，然后进行各项指标检测。

表1 泥鳅解冻方式Tab.1 Thawing methods of loach

1.4 理化指标的测定

1.4.1解冻时间的确定

将温度探头放入鱼体中心，直至鱼肉中心温度达到2 ℃，记录解冻时间。

1.4.2解冻损失率的测定

精确测量泥鳅解冻前后的质量，按照式(1)计算解冻损失率。

(1)

式(1)中：m1为冻结前泥鳅的质量，g；m2为解冻后泥鳅的质量，g。

1.4.3蒸煮损失率的测定

称量5 g的泥鳅样品，放入50 mL的离心管中，放入沸水浴中蒸煮10 min，冷却后吸干表面水分，按式(2)计算蒸煮损失率。

(2)

式(2)中：m1为蒸煮前样品的质量，g；m2为蒸煮后泥鳅的质量，g。

1.4.4泥鳅鱼肉pH值的测定

称取解冻后的泥鳅背部肌肉10 g，剪碎后加入90 mL蒸馏水，高速匀浆1 min，4 ℃浸泡20 min，过滤后用pH计测定滤液的pH值。

1.4.5解冻后泥鳅鱼肉蛋白质溶解性的测定

参照Joo[2]的方法并进行适当改进，测定蛋白质的溶解性。

1) 肌浆蛋白质的测定。取泥鳅鱼脊背部肌肉1 g，加入10 mL pH值为7.2的磷酸缓冲液(提前配置放入4 ℃冰箱1 h后使用)，3 000 r/min匀浆1 min，4 ℃抽提6 h，在离心速度为4 000 r/min，温度为4 ℃的条件下离心20 min。上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

2) 总可溶解蛋白质的测定。取泥鳅鱼脊背部肌肉1 g，加入20 mL 4 ℃KI(1.1 mol/L)，3 000 r/min匀浆1 min，4 ℃抽提6 h，在离心速度为4 000 r/min，温度为4 ℃的条件下离心20 min。上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

3) 肌纤维蛋白质的测定。肌纤维蛋白质=总可溶解蛋白质- 肌浆蛋白质。

1.4.6解冻后泥鳅鱼肉质构特性分析

泥鳅解冻后的黏聚性、弹性、咀嚼度及硬度采用质构分析仪测定。TPA的设置参数：测定部位(泥鳅脊背部组织)；样品压缩形变量30%，测前速度2.0 mm/s，测中速度1.0 mm/s，测后速度1.0 mm/s，触发力5 g；选用平底柱形探头P/36R。

1.4.7解冻后泥鳅鱼肉微观结构分析

取解冻后泥鳅背部肌肉，剪切成大小为0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的组织，放在体积分数为4%的戊二醛溶液中固定12 h。用体积分数为50%、70%、80%、90%的乙醇及无水乙醇依次洗脱，进行冻干[3]。喷金后用扫描电镜(SEM)观察泥鳅鱼肉纵切面的微观结构，放大倍数为200倍。

1.4.8解冻后泥鳅鱼肉水分分布分析

将泥鳅鱼肉样品放入与纤维方向垂直的圆柱形核磁管(直径14 mm，高20 cm)中，置于直径为18 mm的NMR 探头上，使用标准油样和FID序列进行校准。校准参数：NS(重复扫描次数)=2，TW(重复扫描等待时间)=1 000 ms。用CPMG(Carr，Purcell，Meiboom，Gill)脉冲序列测量肉样的横向弛豫时间(T2)，CPMG实验参数设置为：NECH(回波个数)=4 000，TW=3 000 ms，TE(回波时间)=0.6 ms，NS=8。

1.5 数据处理

每个样品进行3次平行实验，数据处理采用SPSS 20软件，采用Origin 8软件绘图。

2 结果与分析

2.1 解冻方式对冷冻泥鳅品质的影响

不同解冻方式对冷冻泥鳅品质的影响实验结果见表2。不同解冻方式对泥鳅解冻损失率的影响存在显著差异(P<0.05)，其中，微波解冻的损失率最大，流水解冻的损失率最小。鱼肉在冷冻过程中形成冰晶，肌肉组织受到挤压，造成细胞失水。在解冻过程中，冰晶融化，部分水渗透回细胞，剩余部分流失，造成解冻损失。郭恒等[4]在研究解冻温度对冷冻鲐鱼品质的影响时发现，与空气解冻、4 ℃解冻、静水解冻相比，流水解冻的损失率最小。解冻速率越大，解冻损失率越大。微波解冻时间最短，速率最大，解冻损失率也最高；超声解冻过程中，鱼肉表面的温度高于内部中心温度，降低了肌肉蛋白的持水力[5]，超声解冻表现出较高的解冻损失率。

表2 不同解冻方式对冷冻泥鳅品质的影响Tab.2 Effects of different thawing methods on quality of frozen loach

蒸煮损失率由大到小按解冻方式排列顺序为：微波解冻、室温解冻、超声解冻、4 ℃解冻、流水解冻、新鲜样品。在解冻过程中，肌肉蛋白发生变性，使其维持水分的能力下降，造成汁液流失[6]。微波解冻的蒸煮损失率最高，这是由于微波解冻的环境温度高，加剧了泥鳅蛋白质的聚集及形变的程度[7]，持水力下降。Shore[8]研究超声在食品冻结和解冻过程中速度和衰减特性时发现，冻结后食品吸收超声波的能力急剧增强，超声波会使泥鳅的肌肉纤维间隙变大，持水能力下降，造成蒸煮损失率变大，这与鱼肉的微观结构结果一致。

鱼体死后中断供氧，体内的肌糖原由有氧分解转化为无氧酵解，产生H+，同时，三磷酸腺苷为无氧酵解提供能量，产生磷酸等酸性物质，这些酸性物质导致了鱼肉pH值下降[9]。解冻后泥鳅鱼肉的pH值均下降，其中4 ℃解冻的下降最明显。超声解冻和流水解冻的pH值与新鲜泥鳅无显著差异。4 ℃解冻的pH值最低，推测是解冻时间过长，细胞无氧酵解时间长，酸性物质积累多。此外，解冻过程中鱼肉表面存在细菌，加速食品的酸败。微波解冻的pH值较低可能与水分损失和解冻温度过高有关。pH值可作为判断鱼类新鲜度的指标之一，有研究表明，pH值变化会影响肉类的颜色以及持水力，并呈正相关[10]。

2.2 解冻方式对冷冻泥鳅蛋白质溶解性的影响

解冻方式对蛋白质溶解度的影响，实验结果见表3。肌肉蛋白的溶解性是指总肌肉蛋白可进入溶液的蛋白量所占的比例，这些蛋白在一定的离心力作用下不发生沉淀。蛋白质与水之间的作用力主要是蛋白质中的肽键，或氨基酸的侧链基团同水分子之间发生的相互作用。鱼肉在冻结- 解冻的过程会增加蛋白质的去折叠和变性程度，导致蛋白质可溶性降低[11]。解冻后肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和全蛋白的含量均有所下降，其中，微波解冻损失的可溶性蛋白最多，超声解冻相对于其他解冻方式可溶性蛋白损失最小。Leygonie[12]研究发现，解冻温度的升高会使蛋白质疏水基团数目增加、三级结构被破坏，导致蛋白间的交联，引起蛋白溶解性的降低。根据 Przybylski[13]的报道，肌肉渗出物是肌浆蛋白的良好来源，因此，水溶性蛋白含量变化可用解冻损失来解释，即高解冻损失对应低可溶性蛋白含量。研究表明，一定程度的超声处理可增加可溶性蛋白含量，提高蛋白溶解性[14]，这是由于超声的空化作用使蛋白质结构变得疏松，使疏水性多肽展开朝向脂质而极性部分朝向水相[15]。

表3 解冻方式对蛋白质溶解度的影响Tab.3 Effect of thawing methods on protein solubility mg/g

2.3 解冻方式对冷冻泥鳅鱼肉质构特性的影响

解冻方式对冷冻泥鳅鱼肉质构特性的影响，实验结果见图1。质构是肉制品主要的感官指标之一，直接关系到嫩度、口感、可食性和加工出品率[16]。不同解冻方式表现出的质构特性差异主要与肌肉中的蛋白质在解冻过程中物化性质和新鲜度有关[17]。解冻过程中蛋白质发生自溶作用，逐渐分解成小分子物质，肉的质构特性发生变化。黏聚性反映鱼肉抵抗外界损伤而紧密连接使其保持完整性的能力。5种解冻方式的黏聚性较新鲜鱼肉均有下降，其中，4 ℃解冻泥鳅鱼肉的黏聚性最高，超声解冻最低。解冻环境的温度会影响黏聚性的大小，呈正相关，这是因为温度升高会使细胞结合力不断下降。超声解冻黏聚性下降可能是因为超声在传播过程中会产生热效应和机械效应，破坏细胞结构，造成细胞结合力减小。弹性反映的是鱼肉受到形变后恢复原样的能力。流水解冻鱼肉的弹性最好，微波和超声弹性较低，这是由于微波和超声的热效应致使肌动球蛋白变性，弹性减小。微波处理温度最高，解冻后的鱼肉弹性最小。硬度和咀嚼度的变化趋势一致，微波解冻的咀嚼度最高，这种变化主要与肌肉组织蛋白变性有关。

2.4 各项指标相关性分析

各指标相关性分析结果见表4。解冻损失率与蒸煮损失率呈显著正相关，与肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和全蛋白的溶解度呈极显著负相关，与解冻pH值呈显著负相关。蒸煮损失率与解冻pH值、肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和全蛋白的溶解度呈极显著负相关，与硬度呈极显著正相关。解冻pH值与蛋白质的溶解性呈极显著正相关。肌浆蛋白溶解性与全蛋白呈极显著正相关，与硬度呈极显著负相关，肌原纤维蛋白与其他指标的相关性与肌浆蛋白相似。全蛋白与硬度呈极显著负相关。对此9项指标进行相关性分析具有重要意义，有利于简化和筛选指标，提高结果分析的准确性[18]。本实验中，肌浆蛋白的溶解性与其他指标均呈极显著相关，因此，可选用该指标来判断解冻效果。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图1 解冻方式对泥鳅鱼肉质构特性的影响Fig.1 Effect of thawing methods on texture characteristics of loach

表4 指标的相关性分析

2.5 不同解冻方式泥鳅肌肉超微结构分析

不同解冻方式泥鳅肌肉超微结构见图2。图2结果表明，新鲜泥鳅肌肉纤维排列紧密，解冻后的肌肉纤维都出现了不同程度的肌肉空隙。Pisal[19]研究发现，蛋白质变性和内膜破裂可导致肌纤维结构的破坏。解冻方式不当，肌原纤维容易发生结构断裂[20]，解冻过程可直接改变肌肉的微观结构，导致保水力发生变化。从微波解冻鱼肉的SEM图可以明显看出肌肉纤维已出现断裂、变性。超声解冻的空隙最大，是因为超声具有机械效应和空穴效应，较大的超声功率会产生空泡，使肌肉纤维发生变形。肌肉纤维的破损程度表明了蛋白质的变性程度，微波解冻肌肉纤维的破损程度最高，蛋白质变性程度也最高。肌肉纤维空隙变化规律与解冻损失率、蛋白质溶解性变化规律一致。肌肉纤维间隙的变大还会引起鱼肉中自由水含量的增多[21]，这与水分分布结果相一致。

图2 不同解冻方式泥鳅鱼肉的SEM图Fig.2 SEM images of loach meat with different thawing methods

2.6 不同解冻方式泥鳅鱼肉的水分分布分析

不同解冻方式泥鳅鱼肉的T2分布见图3。由图3可见，T2谱图上出现3个峰，从左到右依次为结合水、不易流动水、自由水。T20代表与大分子结合最紧密并且不受外界压力影响的水分状态，T21是存在于肌纤维及膜之间的水分状态，T22是存在于细胞外间隙的水分状态，主要是靠毛细管凝结作用而存在于肌肉中的自由水[22-24]。图3表明，新鲜样品和微波解冻有3个峰(T20、T21和T22)，其余解冻方式只有2个峰(T21和T22)，其中T21峰面积、信号强度最大，说明泥鳅鱼肉中水分主要以不易流动水的形式存在。

图3 不同解冻方式泥鳅鱼肉的横向弛豫时间分布Fig.3 Distribution of transverse relaxation time of loach with different thawing methods

不同解冻方式泥鳅肉样T2的变化见表5。微波解冻后，T20峰面积增加，室温解冻、4 ℃解冻、流水解冻和超声解冻的结合水消失。从T21、T22峰顶点时间来看，除超声解冻外，其余解冻方式到达峰顶点的时间均延迟；从T21的峰面积来看，除流水解冻外，其他解冻方式样品的不易流动的水均有不同程度的下降；从T22的峰面积来看，流水解冻和超声解冻的峰面积显著增加，室温解冻、4 ℃解冻、微波解冻的峰面积减少。超声解冻的T22面积最大，可能与超声的机械效应有关，机械效应可将部分不易流动的水转移至细胞外，成为自由水。从T2总面积来看，解冻后总面积均减少，其中微波解冻的损失最高，流水解冻的损失最小，这与本文之前的解冻损失率研究结果相一致。利用LF-NMR可研究物料中的水分分布和流动性情况[25]。解冻后，微波的T20峰右移并且峰面积有所增加，这可能是由于微波加强了水与蛋白质之间的相互交联作用，使部分水转变成结合水。通过对5种解冻方式水分分布和研究发现，流水解冻鱼肉样品的水分分布与新鲜样品最为接近，其余样品均表现出不易流动水向自由水迁移的现象，这与其他方式高解冻损失、蒸煮损失、超微结构等指标呈现高度相关。

表5 不同解冻方式泥鳅肉样横向弛豫时间的变化Tab.5 Changes of loach transverse relaxation time in different thawing methods

3 结 论

解冻方式对泥鳅肌肉纤维结构和理化性质具有显著影响，肌浆蛋白溶解度可作为评价解冻后泥鳅质量的关键指标。流水解冻的解冻损失率、蒸煮损失率最小，解冻后鱼肉的pH值、横向驰豫时间总面积与新鲜鱼肉无显著差别，解冻后的泥鳅肌肉纤维排列紧密。微波解冻时间最短，但对鱼肉品质影响最大，水分和营养物质流失严重。超声波的应用可加快解冻速率，促进泥鳅肌肉中盐溶性蛋白质溶解，但是超声波处理后泥鳅肌肉纤维的间隙变大，持水力下降。相比于4 ℃空气解冻、微波解冻、超声解冻、室温解冻，流水解冻是冷冻泥鳅的较佳解冻方式。本研究对不同解冻方式的冷冻泥鳅肌肉组织理化性质和微观结构进行了比较，各种因素对不同解冻方式的影响规律有待于进一步深入研究。