低共熔溶剂提取黄精多糖工艺优化及抗氧化活性研究

汪 涛，周新群，孙君社，2，张志民，2，王民敬，2，胡雪芳，2，裴海生，2，*

(1.农业农村部规划设计研究院 农产品加工工程研究所， 北京 100121；2.农业农村部农产品产后处理重点实验室， 北京 100121；3.贵州大学 酿酒与食品工程学院， 贵州 贵阳 550025)

黄精(Polygonatumsibiricum，PS)是我国首批进入药食同源目录的中药品种，富含多糖、黄酮、多酚、蒽醌、甾体皂苷、生物碱和人体所需的多种氨基酸等重要的活性成分[1]。黄精多糖(Polygonatumsibiricumpolysaccharides，PSPs)是黄精的主要活性成分之一，具有抗氧化[2]、抗衰老[3]、抗疲劳[4]、增强免疫[5]、治疗糖尿病[6]和预防老年痴呆[7]等作用。Long等[8]用生理盐水和PSPs溶液分别处理荷瘤小鼠，发现PSPs通过激活TLR4受体来阻碍肺癌MAPK/NF-kB信号通路，发挥免疫增强作用，表明PSPs未来有可能用于预防肺癌的发生。

目前，PSPs提取技术主要集中在热水浸提、碱提、酶解、微波和超声波辅助提取等，但美中不足的是这些技术存在能耗大、效率低、价格昂贵和污染环境等诸多问题，最关键的是它们很难应用于大批量的工业化生产[9-10]。为了解决这些问题，需要开发一种新型的提取方法。低共熔溶剂(deep eutectic solvents，DESs)是由氢受体与氢供体按合适比例混合加热形成的液态混合溶剂，其凝固点比任何一种配位剂都要低，具有不易挥发、价格低、毒性小、绿色环保、容易制备、不需要纯化等优势，更重要的是它可以适用于工业化生产[11-14]。目前，DESs的应用主要集中在化工方面，在药食方面相对较少。Tang等[15]应用DESs提取白柏中黄酮类化合物，与热水浸提法相比较，黄酮类化合物槲皮素、杨梅素和穗花杉双黄酮提取率分别增加了128.7%、111.7%和111.1%。Chanioti等[16]选取DESs中氯化胆碱- 柠檬酸(DES-CA)和胆碱氯化物- 乳酸(DES-LA)分别提取橄榄渣中酚类化合物，发现DES-CA提取的总酚含量和抗氧化活性均高于均质化、微波、超声波和高静水压力辅助等提取方法。DESs除了提取黄酮、酚类物质的应用外，已有提取多糖方面的相关报道，如Saravan等[17]利用DESs结合亚临界水提取褐藻多糖，结果表明在150 ℃、1.99 kPa，含水量70%及液料比36.81 mL/g条件下，褐藻多糖的提取率为14.93%。DESs之所以能够增加植物活性物质溶出，可能与其自身的理化性质有关，DESs黏度低且呈弱酸性；黏度低的溶液有很好的渗透能力，再者弱酸性溶液有辅助分解植物细胞壁木质素及纤维素的作用[18]。但到目前为止，未见其应用于提取PSPs的报道。因此，本研究利用DESs提取PSPs，通过响应面分析优化提取工艺，并通过总抗氧化能力试剂盒法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法和邻苯三酚自氧化法对其抗氧化活性进行研究，以期为PSPs工业化提取和功能性研究提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄精(Polygonatumsibiricum)，辽宁澳地森生物工程有限公司。

氯化胆碱，上海国药控股化学试剂有限公司；乙二醇、柠檬酸、丙三醇、尿素、草酸、浓硫酸、苯酚、邻苯三酚、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基、抗坏血酸，国药集团化学试剂有限公司；总抗氧化能力测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV- 1780型紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司；GM- 0.5型隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司；HWS- 26型电热恒温水浴锅，苏州江东精密仪器有限公司；RE- 52B型旋转蒸发仪，上海上自仪转速表仪表电机有限公司；AR223CN型电子天平，奥豪斯(常州)仪器有限公司；H1850型台式离心机，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1PSPs提取方法与测定

热水浸提法[19]：称取0.2 g黄精粉(80目)，在温度80 ℃、液料比1.5 mL/g的条件下提取120 min，重复提取2次得到黄精多糖。

DESs提取法：称取0.2 g黄精粉(80目)与DESs混匀，水浴提取。待提取结束后，加5.0 mL蒸馏水终止反应。真空抽滤，收集滤液，蒸发浓缩，加入无水乙醇至最终含量为80%，静置醇沉2 h，7 000 r/min离心8 min得到粗多糖。

提取实验均重复3次，采用苯酚- 硫酸法[23]测定PSPs含量。葡萄糖标准曲线：y=0.008 2x+0.028 3，R2=0.999 1。按式(1)计算PSPs提取率:

(1)

式(1)中，ρ，PSPs水溶液质量浓度，μg/mL；V，PSPs水溶液体积，mL；d，稀释倍数；M1，样品干质量，g。

1.3.2DESs配位剂对PSPs提取率的影响

将乙二醇- 氯化胆碱(DES-EC)、柠檬酸- 氯化胆碱(DES-GC)、丙三醇- 氯化胆碱(DES-CC)、尿素- 氯化胆碱(DES-UC)、草酸- 氯化胆碱(DES-OC)分别按氢受体与氢供体物质的量比2.0混匀，在100 ℃水浴至溶解。在温度80 ℃、液料比20 mL/g、时间30 min条件下，按1.3.1实验步骤分别提取PSPs并计算提取率。

1.3.3单因素实验设计

在DESs配位剂筛选结果的基础上，分别选取DESs配位剂物质的量比(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)、温度(70、80、90、100、110 ℃)、时间(15、30、45、60、75 min)和液料比(10、20、30、40、50 mL/g)进行单因素实验，考察各因素对PSPs提取效果的影响，按1.3.1节实验步骤分别提取PSPs并计算提取率。

1.3.4响应面优化试验

在单因素实验的基础上，确定最适温度，并利用响应面分析法对其余3个因素进一步优化。根据Box-Behnken试验设计原理，选取尿素- 氯化胆碱物质的量比(A)、时间(B)及液料比(C)3个因素为自变量，以PSPs提取率为响应值，进行三因素三水平的响应面分析，优化PSPs的提取工艺，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5DESs重复利用实验

按照1.3.1节DESs提取PSPs方法，将醇沉离心得到的上清液真空蒸发至体积不变以回收DESs，根据1.3.4得到的优化工艺条件重复利用DESs提取PSPs，按式(1)、式(2)计算PSPs提取率和含量。

(2)

式(2)中，ρ，PSPs水溶液含量，μg/mL；V，PSPs水溶液体积，mL；d，稀释倍数；M2，粗多糖干质量，g。

1.3.6PSPs抗氧化活性测定

(3)

式(3)中，A0，蒸馏水代替样品的吸光度；Ax0，蒸馏水代替邻苯三酚的吸光度；Ax，样品的吸光度。

1.3.6.2 DPPH自由基清除率的测定

取2.0 mL不同质量浓度的PSPs与2.0 mL 0.2 mmol/LDPPH溶液混匀，暗反应30 min，蒸馏水调0，在波长517 nm处测定吸光度(Ax)；同样测定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液与2.0 mL 体积分数70%乙醇溶液的吸光度(A0)，以及2.0 mL不同质量浓度的PSPs与70%乙醇溶液的吸光度(Ax0)[21]。按式(4)计算DPPH自由基清除率。

(4)

1.3.6.3 总抗氧化能力测定

根据总抗氧化能力测定试剂盒操作步骤测定不同质量浓度的PSPs总抗氧化能力[22]。按式(5)计算PSPs的总抗氧化能力。

(5)

式(5)中，总抗氧化能力，μg/mL；V反，反应液体积，mL；V样，取样液体积，mL；d，稀释倍数。

1.4 数据处理

采用Design Expert 8.0.6、Origin 2017和SPSS 19对实验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 DESs配位剂对PSPs提取率的影响分析

DESs选择不同的配位剂结合，可以得到具有特定理化性质的溶剂。根据配位剂的性质可以将DESs分为3种类型：I类由季铵盐和MClx形成，该类与金属卤化物/咪唑盐体系类似；Ⅱ类由水合金属卤化物与氯化胆碱形成；Ⅲ类由氢受体与氯化胆碱组成，氢受体通常是酰胺、羧酸或醇[11,23]。Ⅰ、Ⅱ类具有金属离子性质，不适合在药食方面的应用，这里主要考察Ⅲ类DESs，在此基础上选择乙二醇- 氯化胆(DES-EC)、柠檬酸- 氯化胆碱(DES-GC)、丙三醇- 氯化胆碱(DES-CC)、尿素- 氯化胆碱(DES-UC)、草酸- 氯化胆碱(DES-OC)作为提取PSPs的研究对象。这5种DESs按物质的量比2.0混合溶解，在温度80 ℃、液料比20 mL/g条件下，提取PSPs 30 min，结果如图1。DES-UC对PSPs提取效果最好，多糖提取率为15.11%。与热水浸提得到的PSPs提取率(7.73%)进行比较，PSPs提取率由大到小依次为DES-UC、 DES-OC、 DES-CC、 DES-GC、DES-EC、热水浸提。引起PSPs提取效果差异的原因一方面可能是DESs的理化性质，如黏度、极性和溶解度不同；另一方面可能是DESs与PSPs之间的键能和静电作用[24]。根据实验结果，选择DES-UC作为后续的研究对象。

图1 DESs配位剂对PSPs提取率的影响Fig.1 Effect of DESs complexing agent on extraction rate of PSPs

图2 不同因素对PSPs提取率的影响Fig.2 Effect of different factors on extraction rate of PSPs

2.2 单因素实验结果

PSPs的单因素实验结果见图2。当尿素- 氯化胆碱物质的量比小于1.0时，液态DESs迅速凝固无法与黄精粉混合均匀，不利于PSPs的提取，所以选取物质的量比1.0、1.5、2.0、2.5、3.0为研究参数。由图2(a)可知，PSPs提取率随物质的量比的增加而减小，与DESs特定的理化性质，如酸碱度、溶解度和黏度等对黄精细胞壁的影响有关[17,25]。所以本实验选取尿素- 氯化胆碱物质的量比1.0作为后续研究参数。

当温度低于70 ℃时，DESs无法形成液态溶剂，所以选取温度70、80、90、100、110 ℃为研究参数。由图2(b)可知，PSPs提取率随温度的升高而降低，可能是温度过高使PSPs发生了降解，而且温度对DESs的黏度、导电率和酸碱度等性质也有影响。所以本实验选取温度70 ℃作为后续研究参数。

由图2(c)可知在一定的时间范围内，PSPs提取率随时间的增加而增加；当达到一定时间后，反应体系达到平衡，PSPs提取率随之降低，可能是提取时间过长使多糖分子发生了过度降解。PSPs提取率在60 min时达到最大值，所以本实验选取时间60 min作为后续研究参数。

由图2(d)可知，PSPs提取率随液料比增加呈先增加后下降的趋势，出现这种趋势与DESs的作用程度、黏度有关。液料比过大时，物质间相互作用力太小，使多糖溶出率降低，且过多的溶剂体积会对后续的处理造成困难，增加了工艺的成本；液料比过小使黏度增大，多糖分子截留在DESs中，降低了PSPs提取率。液料比为20 mL/g时，PSPs提取反应体系达到平衡，提取率最大，所以本实验选取液料比20 mL/g作为后续研究参数。

2.3 响应面试验结果

2.3.1响应面试验设计与结果

在单因素实验结果的基础上，设计了三因素三水平的响应面试验。17组试验方案及结果见表2。

2.3.2模型建立与方差分析

表2 响应面试验设计与结果Tab.2 Design and results of response surface experiment

表3 回归方程的方差分析Tab.3 Analysis of variance for regression equation

2.3.3响应面分析

利用Design Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面如图3。等高线图可以直观地反映自变量交互作用的显著性，圆形表示两者交互作用不显著，而椭圆形则表示显著。

由图3可知，时间和物质的量比交互作用的等高线呈椭圆形，表明两者交互作用对PSPs提取率有极显著影响；从三维图可以看出，随物质的量比和时间的增加，PSPs提取率呈先增大后减小的趋势。物质的量比与液料比相互作用的等高线呈椭圆形，表明两者相互作用极显著；从三维图可以看出，随物质的量比和液料比的增加，PSPs提取率呈先增加后减小的趋势。液料比与时间相互作用的等高线几乎呈圆形，表明两者相互作用不显著，这与方差分析结果一致，从三维图可以看出，响应面曲线坡度较为陡峭，表明液料比和时间对PSPs提取率的影响均较大，随液料比与时间的增加PSPs提取率呈先增加后减小的趋势。

图3 各因素交互作用对PSPs提取率的影响Fig.3 Effect of interaction of different factors on extraction rate of PSPs

2.3.4响应面模型预测值验证

通过软件Design Expert 8.0.6分析得到PSPs优化提取工艺参数为物质的量比1.19、提取时间42.30 min和液料比20.75 mL/g，在此条件下PSPs提取率的预测值为18.61%。为了验证响应面结果的可靠性，对所得优化条件进行3组平行实验验证，所得PSPs提取率平均值为18.55%，与预测值接近(相对误差为2.69%)，说明该模型可以准确预测PSPs提取率，优化工艺条件可靠，较传统的热水浸提增加了139.97%。

2.4 DESs重复利用对PSPs提取率及含量的影响

DESs重复使用0～5次时，PSPs提取率分别为18.81%、23.22%、23.47%、34.60%、26.23、22.34%，呈先增加后降低的趋势；在重复使用3次时PSPs提取率达到最大(见图4)。PSPs含量分别为43.25%、55.79%、56.97%、58.97%、63.48%、64.12%，呈现逐渐上升的趋势，说明PSPs纯度越来越高，充分体现了DESs经济节约、绿色环保的特点。出现以上现象可能与DESs热稳定性差有关，不断地高温反复使用，使其黏度及微观结构发生变化。在实验过程也发现重复使用的DESs物理状态发生了变化，在低温下呈液体状态，较新鲜溶剂流动性更大，但具体原因还需进一步探究。

图4 重复使用DESs对PSPs提取率及含量的影响Fig.4 Effect of reuse of DESs on extraction rate and content of PSPs

2.5 PSPs的抗氧化活性分析

图5 PSPs对自由基清除率的影响Fig.5 Effects of PSPs on scavenging rate of free radical

2.5.2DPPH自由基清除能力分析

在测定的PSPs质量浓度范围内，DPPH自由基清除率与PSPs质量浓度具有量效关系，随质量浓度的增加而增加，说明采用DESs提取的PSPs具有一定DPPH自由基清除能力，见图6。经拟合，PSPs曲线方程为y=15.13+23.86x+8.72x2+4.86x3，R2=0.998 1，IC50=0.951 mg/mL。比较IC50可知，DESs提取的PSPs的DPPH自由基清除能力低于抗坏血酸，但显著高于传统水提醇沉法提取的PSPs的DPPH自由清除能力(IC50=19.57 mg/mL)。Zhang等[29]研究发现微波辅助处理PSPs，使其DPPH自由基清除能力增强，主要原因是清除能力最低的组分发生了降解；而DESs的性质类似于离子液，同样具有降解活性物质的能力。另外，当PSPs质量浓度为1 g/L时，DESs提取的PSPs的 DPPH自由基清除率为52.57%，而魏炜等[30]用超高压提取的PSPs的DPPH自由基清除率为34.14%，说明DESs对PSPs抗氧化能力有一定的提高。

图6 PSPs对DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effects of PSPs on scavenging rate of DPPH free radical

2.5.3总抗氧化能力分析

在测定的PSPs质量浓度范围内，总抗氧化能力与质量浓度具有量效关系，见图7。随质量浓度的增加，总抗氧化能力增加，0.2～1.0 mg/mL时总抗氧化能力增加较快；当质量浓度为1.4 mg/mL时，总抗氧化能力为241.2 μg/mL。PSPs的总抗氧化能力略低于同质量浓度的抗坏血酸，但仍具有一定的抗氧化能力。

图7 PSPs的总抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of PSPs

3 结 论