MDM2、GST和STAT3抗原自身抗体联合检测在食管癌早筛中的应用

韩文莉，赵学科，张立国，雷玲玲，孟超龙，胡守佳，程 锟，王盼盼，钟 侃，胡景峰，宋 昕，王 伟，李欣然，杨苗苗，徐瑞华，魏梦霞，李志强，刘太江，张高富，李秀敏，陈志国，王立东

食管癌发病率在上消化道肿瘤中居第2位[1]，我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家，显著的地域性分布差异是我国食管癌突出的流行病学特征之一，河南、河北和山西交界的太行山地区食管癌尤为高发[2]。食管癌患者早期无特异症状，缺乏高危人群预警筛查和早期发现的有效指标和方法，导致其预后极差，中晚期5 a生存率仅为20%左右[3]。食管癌液体活检是近年提出的一种肿瘤无创诊断技术，主要包括肿瘤相关抗原和蛋白检测、高易感基因及其蛋白产物检测、游离循环肿瘤细胞(CTCs)检测、循环肿瘤DNA(ctDNA)检测、外泌体及循环RNA(Circulating RNA)检测等。食管癌是一个多阶段演进的过程，随着疾病的进展，这些标志物会释放入血，通过分析血液中这些小分子标志物，来实现肿瘤的早期筛查、分子分型、预后、用药指导以及复发监测等。本研究通过检测血清中自身抗体，对高发区无症状人群进行多中心筛查应用，为无症状高危人群预警筛查提供重要依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

①收集100例原发性早期食管癌患者的血清(食管癌组)以及100例正常人的血清(对照组)。100例早期食管癌患者中，男性54例，女性46例，年龄39～77(60.4±7.4)岁；100例正常人中，男性50例，女性50例，年龄35～69(51.9±9.8)岁。所有食管癌患者血清都是在术前收集，诊断时间为2010年1月至2015年12月。正常人血清来自门诊胃镜并经活检病理确诊为非癌或非癌前病变的健康人群。②接受流行病学调查的431位无症状居民来自新乡市辉县市食管癌高发区，男性230例，女性201例，年龄35～81(52.1±9.2)岁，中位年龄51岁。流行病学调查和血液样品的收集由卫生院检验科医师和当地村干部和村医协助完成。所有研究对象均排除影响血清自身抗体表达的疾病，如感染、过敏及自身免疫性疾病等。③大规模应用人群为2014年至2019年新乡市辉县市35岁以上无症状者，均无自身免疫性疾病。

1.2 实验方法

1.2.1 血液样品的收集及保存对所选取的研究对象取静脉血5 mL(空腹)置于离心管中，室温静置30 min后，2 000 r·min-1离心20 min，每管吸取血清100L进行分装，放置液氮中保存，而后转-80 ℃冰箱。

1.2.2 血清自身抗体检测应用美国Scripps研究所提取和纯化的MDM2、GST和STAT3 3种抗原联合检测收集的血清标本。使用间接酶联免疫吸附试验法(ELISA)，各包被抗原的稀释终浓度为0.5g·L-1，血清标本稀释浓度为1∶100，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG稀释浓度为1∶3 000。在ELISA板孔中加入稀释后的抗原每孔100L，4 ℃，过夜。加入稀释后的血清每孔100L，每个样品同步设置2个复孔，37 ℃孵育1 h。阳性对照为已知阳性血清，阴性对照为包被缓冲液。先加入稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG 每孔100L，37 ℃孵育30 min；再加入TMB底物显色液，每孔100L，37 ℃避光反应10 min，直至阳性对照颜色明显变化后，每孔再加入终止液50L，终止反应，并在ELISA 检测仪上读取OD450光密度值。

1.2.3 血清自身抗体检测结果判定采用Scripps研究所判定方法，即正常血清OD读数均数±3个标准差，为Cut-off值(截断值)，大于此值为阳性，小于此值为阴性[4-5]。

1.2.4 食管内镜检查和黏膜活检对血清学检测阳性者(3种自身抗体中有至少1种为阳性)进行内镜检查，并常规在食管中段、下段各取1～2块活检组织，并在肉眼可见的病变处随机取材，必要时行碘染色。在食管不染区取材，并均迅速置95%乙醇固定。常规脱水包埋后连续切片9张(厚5m)，其中1张作HE核实组织诊断，剩余8张作免疫组化。

1.2.5 病理组织学和免疫组化检查将食管上皮根据细胞形态和组织结构分为正常、癌前病变和食管癌。采用免疫组化法检测食管组织中上述3种相关抗体。免疫蛋白阳性反应主要定位于细胞质或细胞核，为棕黄色或棕褐色，高倍镜下视野中无阳性细胞或阳性细胞数<10%为阴性；阳性细胞数≥10%为阳性。

2 结果

2.1 各指标的阳性表达率食管癌和对照组人群血清自身抗体阳性检出率差异显著，见表1。3种自身抗体联合检测价值最高，见表2。

表1 两组血清自身抗体MDM2、GST、STAT3阳性检出率比较

表1 两组血清自身抗体MDM2、GST、STAT3阳性检出率比较

表2 各指标的诊断价值

2.2 肿瘤相关抗原自身抗体检测和食管内镜检查结果应用酶联免疫测定法共检测431例食管癌高发区无症状居民血清3种肿瘤相关抗原的自身抗体水平，受检人群的基本特征见表3。结果3个肿瘤相关抗原的自身抗体血清阳性监测指标中，至少有1项呈阳性反应的89例，阳性表达率为20.65%(89/431)，联合检出率明显高于任何单个指标检出率，P<0.05。见表4。

表3 食管癌高发区431例无症状受检人群性别与年龄分布 例(%)

表4 血清自身抗体表达对比食管内镜活检病理结果 例(%)

2.3 高危人群推广应用结果在8 802例无症状人群中，1 584例至少有一项肿瘤相关抗原自身抗体表达阳性，占总人数的18.00%。对这1 584例抗体表达阳性的人群全部行色素内镜检查，结果发现癌前病变352例(4.00%，352/8 802)，食管癌210例(2.39%，210/8 802),早期食管癌198例，贲门癌2例(0.02%，2/8 802)，其余1 020例均正常。

3 讨论

本研究发现MDM2、GST和STAT3联合检测食管癌的敏感度达85%，特异性达70%，可以有效地发现早期食管癌。利用这3种抗体对省内小范围食管癌高发区的无症状人群行血清学自身抗体检测，经内镜和组织病理学检查证实，显著提高了食管癌的检出率。抗体表达阴性组342例人群中，食管癌仅1例。这一结果表明，利用血清自身抗体联合检测并结合内镜和黏膜活检可能是食管癌早期发现的重要途径。该方法可用于大规模无症状人群的筛查，优势是大大降低了检查成本，受检者痛苦小，容易被接受，临床检查周期短，技术含量要求低。然而，仅靠血清学检测仍不能准确定位食管癌患者，自身抗体定性仍需结合内镜和黏膜活检。在血清学检测的基础上，对高危人群行内镜和黏膜组织活检可能是目前对食管癌高发区无症状人群进行大范围普查较好的方案。肿瘤的发展是一个多阶段演进的过程，正常组织发生癌变后，不同肿瘤的病理类型间存在差异，同种病理类型之间有肿瘤的异质性，所以，仅采用单一指标无法对肿瘤做出准确的诊断，联合检测多种相关自身抗体可显著增加食管癌的检出率。依据本实验室之前的研究结果筛选这3种肿瘤相关自身抗体对食管癌高发区无症状人群进行筛查。

MDM2在脑膜瘤、食管癌、胃癌等多种肿瘤中表达，与食管癌的发生、发展和预后关系密切[6]。赵仲生等研究发现食管鳞癌中有MDM2蛋白过表达，提示MDM2癌基因产物的过表达与食管癌的发生、发展有关[7]。李玉琴等阐明MDM2表达可引起胃上皮细胞的恶性转化，抑制MDM2表达能促进胃癌细胞和胃上皮细胞凋亡，并抑制其侵袭，从而发挥抑制胃癌生长和胃上皮细胞恶性转化的作用[8]。本实验室研究也发现MDM2与食管癌相关[9]。

信号转导和转录激活因子3，即STAT3的主要作用是参与信号转导和转录调控，同时也对辅助性T细胞17(Th17)的分化起关键作用。武玉霞等研究发现STAT3蛋白表达影响正常妊娠[12]，许爽等研究表明STAT3在动脉粥样硬化中起重要作用[13]，李福青等研究发现STAT3与结直肠腺癌密切相关[14]，王健等证明STAT3与食管癌病理特征相关[15]。

肿瘤细胞具有高速占位性增殖、浸润与转移等特点，基本可自我免疫耐受。肿瘤相关抗原在正常组织细胞中也可有微量合成，并不是肿瘤细胞特有，两者仅有表达量的差异，因此称为相关抗原，针对这些抗原，机体产生相应的自身抗体。

从实验室研究到用于高发区无症状高危人群，本研究的方法比过去没有液体活检更好，但仍然存在一定的局限性，假阳性、假阴性仍然不可避免，需要优化组合更多的指标进一步探讨，比如食管癌相关的基因、蛋白、自身抗体、miRNA、甲基化等。由于同一种肿瘤中可同时出现不同的肿瘤标志物，同一标志物也可在多种肿瘤中均有表达量的变化，所以联合检测多种血清肿瘤相关自身抗体将有助于提高早期食管癌的检出率。自身抗体检测联合内镜黏膜活检可能是食管癌早期发现的重要手段。