食管癌高危人群筛查的MDM2-BRCA2-MGMT自身抗体联合检测试剂盒研究

2021-01-07 10:31魏梦霞雷玲玲李学民韩文莉赵学科孟超龙胡守佳王盼盼胡景峰李欣然杨苗苗徐瑞华吉佳佳王伟鹏王立东
食管疾病 2020年4期
关键词:抗原食管癌内镜

魏梦霞,雷玲玲,李学民,韩文莉,赵学科,孟超龙,胡守佳,程 锟,3,王盼盼,钟 侃,胡景峰,宋 昕,王 伟,3,李欣然,杨苗苗,徐瑞华,吉佳佳,王伟鹏,王立东

食管癌(esophageal cancer,EC)是一种极具中国特色的恶性肿瘤,全球每年新发57.2万例,2/3发生在中国[1],2015年中国食管癌发病率和死亡率均居消化道恶性肿瘤第二位[2]。临床发现早期食管癌患者较少,95%患者就诊时已为中晚期癌,5 a生存率仅为15%~20%[3]而临床就诊早期癌患者5 a生存率可达90%。筛选和建立用于大范围无症状人群早期发现和高危人群预警的指标和方法,是提高食管癌早期发现率,降低食管癌死亡率的关键解决措施[4]。癌细胞在其发生和发展过程中会合成并释放出一组其特有的分泌性抗原,即肿瘤相关抗原,因而患者血清中可能会存在这些抗原对应的自身抗体,因此检测患者血清中的自身抗体有助于癌症病人高危人群预警和筛查[5]。同时,相关研究表明,肿瘤具有异质性,即使同一肿瘤也可能有不同的抗原表达。目前,人们尚未找到针对某一肿瘤的单一分子标志物,因此,与单个自身抗体检测方法相比,用多种肿瘤相关抗原联合检测患者体内自身抗体的表达情况,有利于提高针对某一肿瘤的检出率。近年研究发现了一组食管癌特异相关蛋白分子指标(MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白等)[6-7],利用这些变异分子进行优化组合对食管癌高危人群进行分子学检测,并利用液体活检技术首先确定无症状人群中的高危人群,再对这些高危人群进行色素内镜和黏膜靶向活检及病理学检查,是食管癌高发区大规模无症状人群癌前病变和早期癌筛查的重要策略之一。本研究采用自身抗体筛查技术对食管癌高发区无症状食管癌人群进行筛查应用,为无症状食管癌高危人群预警筛查提供重要依据。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 分子指标优化组合ELISA试剂盒制备

1.1.1 第一组400例人群血清样本检测

ELISA试剂盒组成:MDM2、BRCA2和MGMT抗原包被的96孔酶标板;样品稀释液:含有1%(W/V)BSA的PBST缓冲液;第二抗体稀释液:含有1%(W/V)BSA的PBST缓冲液;酶标抗原:辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(Invitrogen公司);显色液:显色液由显色液A和显色液B组成,其中,显色液A为0.02%(W/V)TMB,显色液B为0.006%(W/V)过氧化脲素;使用时将显色液A和显色液B按照1∶1等体积混合均匀;终止液:10%的硫酸;洗涤液:pH7.4的0.01 M的PBST(磷酸盐)缓冲液;阳性对照血清:MDM2(BRCA2或MGMT)阳性对照血清;阴性对照血清:MDM2(BRCA2或MGMT)阴性对照血清,以上样品分别包装后与抗原包被的96孔酶标板构成食管癌早期筛查ELISA试剂盒。

取样品血5 mL于10 mL离心管中,室温静置30 min后,2 000 r·min-1离心15 min,分离上层血清样本0.1 mL并加入样本稀释液(1∶500稀释,V/V),将稀释后的血清样本加入已被抗原包被的96孔酶标板反应孔中,每个孔的样本添加量为0.1 mL,37 ℃孵化1 h,弃去反应孔中液体,洗涤液洗涤5次以上。

辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体中加入第二抗体稀释液(1∶40 000,V/V),取0.1 mL加入96孔酶标板反应孔中,37 ℃孵化50 min,弃去反应孔中液体,洗涤液洗涤5次以上。

A显色液和B显色液等体积混合后取0.1 mL迅速加入至96孔酶标板反应孔中,37 ℃避光孵化15 min,加入终止液0.05 mL,20 min内于检测波长450 nm和参比波长595 nm测定OD值,并用空白对照孔调零。

以阴性对照孔所测OD值得平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值),反应孔中OD值读数大于等于截断值判断为阳性,反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

1.1.2 研究样本信息收集正常人血清200份(对照组)和早期食管癌患者血清200份(食管癌组),样本来自于省部共建食管癌防治国家重点实验室5.4万样本库。对照组样本人群男女比例1∶1,年龄(60±8)岁,该血清来自该重点实验室合作意愿体检中心的健康体检人群,无肿瘤相关证据;食管癌组样本人群男女比1∶1,年龄(52±10)岁,实验组血清样本均经组织病理学证实为早期食管癌(0期和Ⅰ期)。

1.1.3 样本处理对照组和食管癌组居民静脉取血5 mL,室温下静置30 min后,2 000 r·min-1离心15 min,分离上层血清样本0.1 mL,液氮保存12 h内转入实验室,-80 ℃冰箱储存。

1.2 第二组403例无症状人群筛查验证

1.2.1 研究样本在食管癌高发区河北省邯郸磁县,对志愿接受体检的无症状居民进行流行病学调查,其中参与调查和体检的居民共403人,男性212人,年龄(53±10)岁;女性191人,年龄(53±10)岁。流行病学调查前先由当地村干部和乡村医生帮助发放和讲解知情同意书,对同意接受检查的人开始询问家族病史并进行体检,填写基本信息调查表,包括各种肿瘤的家族史。所有被检者均排除急性感染、过敏、自身免疫性疾病等影响蛋白表达的疾病。

1.2.2 食管癌早期筛查对上述403例无症状居民静脉取血5 mL,样本处理步骤同1.1.3。对每个血清样本进行血清学检测,具体检测步骤同1.1.1。

1.2.3 组织病理学检测对上述403例无症状人群血清学检测阳性和阴性居民均进行色素内镜检查,并在常规的食管上段、中段和下段取1~2块活检组织,并在肉眼可见的病变部位取材,必要时进行食管黏膜碘染色,在食管不染区取材,所有活检组织均迅速置85%乙醇固定。对色素内镜所取活检组织全部固定、脱水、切片、HE染色,做组织病理学诊断。

1.3 第三组19 415例人群大规模筛查

1.3.1 研究样本1973年以来,河北省多家城乡医院包括河北医科大学第四医院等对磁县食管癌高发区长期坚持下乡普查,建立了多个肿瘤防治点,自2011年以来,对19 415例30~70岁无症状人群进行食管癌高危人群和早期癌液体活检筛查,其中男性9 615人,年龄(56±11)岁,女性9 800人,年龄(56±11)岁。

1.3.2 食管癌早期血清筛查对上述19 415例无症状人群进行食管癌高危人群和早期癌液体活检筛查,发现3 980例高危人群(20.50%,3 980/19 145)和15 435例非高危人群,对该3 980高危人群进行色素内镜检查,取活体组织,并进行组织病理学诊断。3组样本食管癌患者早筛过程如图1所示。

图1 食管癌患者早筛流程图

2 结果

2.1 食管早期筛查ELISA试剂盒血清检测3种自身抗体在食管癌组和对照组中的血清抗体检测结果如表1所示。检测后,食管癌组患者血清MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白抗体水平显著高于对照组。食管癌组MGMT抗体表达阳性占13.75%,对照组MGMT抗体表达阳性占3.25%,食管癌组MDM2抗体表达阳性占18.50%,对照组MGMT抗体表达阳性占3.75%,食管癌组BRCA2抗体表达阳性占19.25%,对照组BRCA2抗体表达阳性占3.75%;3种自身抗体相比较,BRCA2抗体在食管癌组中的表达率明显高于MDM2抗体,MGMT抗体表达率最小;在食管癌组中,单一自身抗体表达阳性的人数明显低于阴性人数,MGMT抗体表达阳性占13.75%,MGMT抗体表达阴性占36.25%;3种自身抗体OR值均大于1,表明MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白抗体三者均为患病的危险因素;P<0.001(SPASS 20.0)表明差异有统计学意义。

表1 3种自身抗体在食管癌组和对照组中的血清抗体检测 例(%)

2.2 3种肿瘤相关抗体组合检测结果3种肿瘤相关自身抗原自身抗体检测结果如表2所示,可以看出随着组合数目的增多,检测灵敏度随之升高,特异度不断降低;3种自身抗体组合检测灵敏度最高,高达89.50%,表明3种自身抗体组合检测正确诊断为食管癌的概率为89.50%;3种指标结合时检测特异度仍能达到89.50%,表明非食管癌患者采用3种指标联合检测时,被正确诊断为未患食管癌的概率为89.50%;采用MGMT、MDM2和BRCA2这3种肿瘤相关抗原自身抗体组合进行食管癌早期诊断,在保证诊断特异度的前提下大幅度提高了诊断灵敏度;约登指数随着肿瘤相关抗原组合数目的增多逐渐增大,趋于1,表明3种肿瘤相关组合指标用于诊断肿瘤价值较大,该方法诊断和早期筛查食管癌应用价值较高;采用MGMT、MDM2和BRCA2这3种肿瘤相关抗原自身抗体组合联合检测方法优化组合,对食管癌高危人群进行血清自身抗体检测,首先确定无症状人群中的高危人群,既能保证较高的特异度,又能提高诊断灵敏度,对评估待测对象患食管癌的风险具有较好的诊断和应用价值。

表2 3种肿瘤相关抗原抗体检测结果 例(%)

2.3 403例人群血清学和组织学检测第二组高发区403例无症状人群年龄和性别分布如表3所示,男性总人数(205例)略高于女性总人数(199例);无论是男性还是女性,主要年龄均分布在50~59岁,其次为60~69岁、40~49岁。对403例无症状人群进行食管有色内镜检查和食管上皮组织活检,其中至少有一种自身抗体阳性者90例,3种自身抗体均为阴性者313例。此次403例无症状人群均自愿接受有色内镜检查和食管上皮组织活检,结果发现403例无症状人群中食管上皮正常346例,癌前病变41例。检出早期食管癌14例,其中13例在自身抗体阳性组;检出其他肿瘤2例,分别是自身抗体阳性组1例和自身抗体阴性率1例。自身抗体阳性组和自身抗体阴性组的色素内镜检查结果见表4。

表3 第二组高发区403例无症状人群食管癌早筛年龄性别分布 例(%)

表4 403例无症状人群血清自身抗体表达对比及食管内镜活检病理人数结果 例(%)

2.4 第三组河北磁县19 415例无症状人群食管癌早期筛查情况河北医科大学第四医院与磁县人民医院联合承担国家“十一五”重大科技支撑项目“食管癌早诊早治普查工程”,自2011年起,共对19 415例无症状人群进行食管癌高危人群和早期癌液体活检筛查,共发现3 980例高易感人群(20.5%,3 980/19 145);对这些高危人群进一步进行色素内镜和黏膜活检病理检查,共发现1 553例癌前病变患者;626例上消化道肿瘤患者,包括582例食管癌和44例其他消化道肿瘤;582例食管癌患者中,早期食管癌占86.6%(504/582)。

3 讨论

本研究通过检测血清中3种食管癌相关抗原(MDM2、BRCA2和MGMT),探讨血清学检测作为高危人群和早期食管癌筛查的可能性。本研究的优势在于,利用间接酶联免疫吸附法对食管癌组和对照组进行3种血清自身抗体检测,发现3种血清自身抗体联合检测时其敏感性和特异性最优,均为89.50%。本研究又在食管癌高发区对403例无症状人群行联合血清自身抗体检测,且对所有受试者行色素内镜检测,提示多种食管癌相关抗原自身抗体联合色素内镜和黏膜活检病理学检查可能是食管癌高发区无症状高危人群和早期发现的重要技术。本研究在食管癌高发区对19 415例无症状人群进行大规模筛查,并对血清学检查阳性受试者行色素内镜检查,证实多种食管癌相关自身抗体联合色素内镜和黏膜活检病理学检查可以有效检出食管癌高危人群和早期癌,并且减少了内镜筛查范围,降低了筛查成本,易于被受检者接受。

本研究中的3种血清自身抗体是根据本实验室或其他研究报道而选择的,这些报道与食管癌都密切相关[8-10],但其机制与自身抗体有关血清中的表达尚不明确。有关研究表明,头颈部、肺癌等许多肿瘤都和血清中自身抗体的过表达密切相关[11-12]。在食管癌中,P53、C-myc、Koc等肿瘤相关自身抗体已被在血清中联合检测[4,13],因此,优化组合的血清自身抗体可用于筛查和早期诊断。

本研究基于MDM2、BRCA2和MGMT这3种优化组合的血清自身抗体联合色素内镜和黏膜活检病理学检查进行病例对照研究,证实了该技术具有被广泛推广应用的价值。单纯血清自身抗体筛查容易出现假阳性,且不是临床诊断食管癌的金标准。单纯色素内镜和黏膜活检病理学筛查范围大、成本高,“陪伴检查”现象严重,受试者不舒服且拒绝检查,还需要经验丰富的内窥镜医师[14]。因此,建立一种快速、经济、患者可接受的筛查技术,首先筛查高危人群,然后进一步进行内镜检查确定食管癌高危人群和早期癌是非常重要且必要的。

本研究结果表明,肿瘤相关抗原自身抗体的组合可以显著提高食管癌和高危人群筛查的敏感性和特异性。应用这3种食管癌相关抗原自身抗体筛查河北磁县食管癌高发区19 415例人群,通过对血清自身抗体阳性人群色素内镜精准检查,发现早期食管癌2.60%,相较于传统内镜筛查早期癌患者的发现率2.00%~3.00%有所提高[15],并且色素内镜检查人群大幅度缩小,节省了大量普查工作的人力、物力和财力。更重要的是,利用该技术,可以精确筛出无症状的高危人群,能够更精准地进行早防、早诊和早治,提高早期食管癌的检出率,延长食管癌患者的生存期,具有巨大潜在的社会效应,非常值得推广应用。

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