Rb、MDM2和Bcl-2自身抗体联合检测在食管癌高发地区人群筛查中的应用

赵学科，马 磊，胡守佳，程 锟，王盼盼，钟 侃，胡景峰，宋 昕，王 伟，李欣然，杨苗苗，徐瑞华，魏梦霞，韩文莉，雷玲玲，孟超龙，库建伟，任书伟，张冬云，王立东

早期食管癌5 a生存率可高达90%[1]，然而早期食管癌患者无特异性临床症状，导致临床就诊的食管癌患者中90%以上为中晚期，其5 a生存率仅为20%左右[2]，因此，食管癌高危人群预警和早期发现成为降低食管癌发病率和死亡率的关键环节。内镜普查有成本高、创伤大、重复性检查、患者依从性低且需要经验丰富的内镜医师等不足，很难在高发区大规模无症状人群筛查中推广应用。

液体活检是近年兴起的一种无创、高效的肿瘤筛查技术[3-4]，主要包括肿瘤相关抗原和蛋白检测、高易感基因及其蛋白产物检测、游离循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)[5]检测、循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA,ctDNA)检测等[6-7]。食管癌变是一个多阶段演进过程，早期病变以食管上皮细胞过度增生为特征，形态学上表现为基底细胞过度增生(basal cell hyperplasia, BCH)、不典型增生(dysplasia,DYS)和原位癌。近年研究提示，食管癌前病变形态改变之前已发生多种基因和蛋白的变化[8]，包括来自肿瘤细胞的一组特异蛋白，后者可以导致宿主细胞产生抗原抗体反应(自身抗体)，这一组蛋白被称为肿瘤相关抗原(tumour-associated antigens,TAAs)。因此，无症状人群血清肿瘤相关自身抗体检测作为一种重要的检测指示，有助于食管癌高危人群筛查和早期发现。本研究旨在对发现的食管癌相关抗原自身抗体进行组合、优化，在食管癌高发区进行多中心无症状人群普查，以实现食管癌高危人群预警和早期发现，降低人群筛查成本，提高食管癌患者生存期。

1 材料与方法

1.1 研究对象第一组实验组人群来自郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室收集的食管癌患者的血清标本215例，患者经组织病理学证实为食管癌，采样前均未接受放疗和化疗治疗。其中男109例，女106例；年龄 37～70(59±7.3)岁。对照组为来自郑州大学第一附属医院体检中心的健康体检人群，其性别和年龄与实验组相匹配。第二组人群为食管癌高发区河南省新乡市辉县市郑屯村自愿接受流行病学调查、血清学自身抗体检查和色素内镜检查的35岁以上无症状居民589例，其中男299例，女290例；年龄35～70(51±8.5)岁。第三组为2010年至2019年食管癌高发区河南南阳、信阳地区的19 986例35岁以上无症状人群，行液体活检，并对高危人群行色素内镜、病理活检检查。

1.2 实验方法

1.2.1 血样采集研究对象填写基本信息调查表，并收集空腹静脉血5 mL，之后将其置于离心管内，在室温下静置30 min后以2 000 r·min-1，离心20 min，吸取血清，每管100 μL分装，-80 ℃保存。

1.2.2 血清自身抗体测定采用间接酶联免疫吸附试验方法，各包被抗原的稀释终浓度为0.5 μg·μL-1，血样稀释浓度为1∶50，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG稀释浓度为1∶5 000。向酶联免疫吸附(ELISA)板孔中加入用包被稀释液稀释过的抗原，每孔100 μL，4 ℃过夜(24 h以上)。加入稀释后的病人血清，每孔100 μL，每个样品至少做2次检测，37 ℃孵育1 h。已知阳性的血清为阳性对照，包被缓冲液为阴性对照。加入稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。加入TMB过氧化脲显色液，每孔100 μL，置37 ℃避光反应10 min，当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50 μL，终止反应，并在ELISA检测仪上读取A450吸光度值。

1.2.3 血清检测结果判定采用Scripps研究所判定方法，即以正常血清A450读数的均数±3标准差为Cut-off值(截断值)，读数在此值以上的为阳性，否则为阴性。有一项自身抗体表达阳性时，该受试者即定义为食管癌高危人群。

1.2.4 蛋白芯片分析针对19 986例35岁以上无症状人群，采用人蛋白质组定制芯片V3.0(CDI Laboratories)检测。每个芯片上包含Rb、MDM2、Bcl-2纯化蛋白质微阵列。每张蛋白芯片可同时检测96例人体血清。从-80 ℃取出微阵列，在阻断缓冲液(3%BSA在PBS)中室温孵育3 h。然后将血清样本以1∶2 000的比例在结合缓冲液(1%)中稀释，将BSA(PBST)加入微阵列中孵育，4 ℃过夜。PBST洗涤后，微阵列与1∶1 000稀释荧光标记山羊抗人IgG(532 nm)在室温避光反应1 h。PBST洗涤后，对微阵列用ddH2O冲洗并干燥。用GenePix Pro6.0(Axon仪器，加拿大)提取每个免疫荧光点的强度，判断抗原抗体免疫反应[9]。

1.2.5 色素内镜检查常规行食管黏膜碘染色，在食管黏膜不染区取材，所有活检组织均迅速置于85%乙醇内固定。

1.2.6 病理组织学检查对胃镜获取的活检组织常规处理后，每张切片厚3 μm，HE染色，作组织病理学诊断。

2. 结果

2.1 3种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌和对照组血清中的检测情况见表1。Rb、MDM2和Bcl-2这3种肿瘤抗原自身抗体在食管癌患者和正常对照人群血清中的阳性检出率(灵敏度)分别为35.81%、32.09%和45.58%，特异度分别为93.49%、94.88%和92.09%；Rb+ MDM2、MDM2+ Bcl-2和Rb+ Bcl-2两种肿瘤抗原自身抗体联合检测，在食管癌患者和正常人群血清中阳性(至少一个指标阳性)检出率(灵敏度)分别为51.16%、61.86%和67.44%，特异度分别为92.56%、91.63%和90.23%。Rb、MDM2和Bcl-2这3种肿瘤抗原自身抗体联合检测，在食管癌患者和正常对照人群血清中阳性(至少一个指标阳性)检出率(灵敏度)高达84.65%，特异度为82.33%。

表1 3种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌和健康对照组人群血清中检测结果自身抗体

2.2 3种自身抗体联合检测食管癌高发区589例无症状人群筛查见表2。589例无症状人群血清中3种肿瘤抗原自身抗体(至少一个指标)阳性检出率为20.90%，共检出125例食管癌高危人群和473例非高危人群；对589例无症状人群进行色素内镜和黏膜活检病理检查，125例食管癌高危人群中共确诊13例(10.40%)早期食管癌、30例(24.00%)各级癌前病变患者；464例非高危人群中确诊2例早期食管癌和6例癌前病变患者，3种自身抗体血清阳性人群(高危人群)中早期食管癌和癌前病变患者检查率明显高于阴性组人群，P<0.001，其灵敏度高达84.65%。

表2 3种自身抗体联合检测及色素内镜、病理活检对589无症状人群高危人群筛查结果对比

2.3 高发区19 986无症状人群高危人群筛查使用3种自身抗体联合检测19 986例无症状人群，共检测到至少一项自身抗体阳性的高危人群3 624例，其中早期食管癌373例(1.87%)，各级癌前病变1 352例(6.76%)，中晚期食管癌21例(0.11%)，其他上消化道肿瘤36例(1.80%)。该组人群早期食管癌及癌前病变患者色素内镜及病理活检检出率与589例无症状人群的检出率相近。

3 讨论

肿瘤细胞生物学具有复杂多态的特性，同种肿瘤病理类型的差异、同种病理类型肿瘤的异质性等原因都造成了癌变过程中产生不同的抗原，通过多个肿瘤相关抗原联合检测自身抗体有助于提高食管癌的检出率[10-11]。本实验室前期工作证明食管癌相关抗原Rb、MDM2、Bcl-2存在明确的自身抗体[12]，本研究检测了3种食管癌相关抗原自身抗体的不同联合检测方法在食管癌高危人群筛查和早期发现中的差异。单个自身抗体阳性时，发生食管癌变的风险是自身抗体阴性人群的7倍多，其灵敏度只有32.09%，而当3个指标联合检测时，只要其中一个指标阳性，就确定为食管癌高危人群，而此时高危人群发生食管癌的风险较阴性组高出25倍多，且敏感性和特异性高达84.65%和82.33%，从而证实多个指标的联合检测判断食管癌高危人群风险的检出率远远高于单个指标的检测。

本研究对589例无症状人群进行食管癌相关抗原Rb、MDM2、Bcl-2这3种自身抗体液体活检，并筛选出高危人群，然后对所有无症状人群进行色素内镜检查，并取食管黏膜上皮做病理学检测和诊断，两种方法比较后发现：液体活检方法确定的高危人群中早期食管癌和各级癌前病变占所有早期食管癌和各级癌前病变患者的84.31%，用色素内镜和病理活检确诊的方法再次证明了本研究利用Rb、MDM2、Bcl-2这3种食管癌自身抗体作为液体活检指标对预测食管癌高危人群的科学性和准确性。同时，用食管癌高发区19 986例无症状人群进行大规模验证，也再次证实了以上结果。本研究结果显示，利用Rb、MDM2、Bcl-2这3种食管癌自身抗体作为液体活检技术筛选出的食管癌高危人群占全部无症状人群的20%左右，可减少80%的无症状人群胃镜筛查，大大节约了医疗资源，减少了大量不必要的陪伴检查和重复检查，受检者也更容易接受。

然而，该组指标阳性的高危人群中，仍有一半左右的无病变人群，色素内镜和活检病理检查均无异常，并且在指标检测为阴性的无症状人群中，仍有一小部分人最终发展为食管癌。在一定程度上，显露出本组液体活检分子在食管癌高危人群预警和早期发现中出现的假阳性和假阴性，仍需对液体活检分子指标进行优化、组合，比如食管癌相关的基因、蛋白、自身抗体、miRNA、甲基化等分子指标。

食管癌的发生发展是一个多阶段演进的过程，是多种基因参与的复杂性疾病，在肿瘤发展过程中，产生肿瘤相关抗原，进而刺激机体产生针对这种肿瘤相关抗原的自身抗体，是目前研究进展最为迅速的一种肿瘤标志物。理想的肿瘤标志物应具有良好的特异性、较高的敏感度，能够明确地区分肿瘤患者和非肿瘤患者。自身抗体存在于患者的血液、细胞或组织中，可通过免疫学、分子生物学等方法测定其含量，对肿瘤的早期诊断、早期发现具有一定的价值。通过血清学检查自身抗体，使得早期诊断肿瘤成为一种可能。