二陈汤加味对慢性阻塞性肺疾病大鼠HMGB1、MMP-2、MMP-9的影响

牛贺 王俊月 李亮 宋倩红 王肖艳 谢文英 包永生

(河南中医药大学，河南 郑州 450046)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)作为一种不完全可逆气流受限的呼吸系统慢性疾病，近年来其发病率在我国逐年上升，已成为排列第3位的疾病负担和死因〔1〕。不仅发病率逐年递增，研究发现COPD并发症丛生，诸如肺动脉高压、肺栓塞、右心衰竭等，同样对患者的生活质量产生了严重的负面影响。目前COPD的发病机制尚不明确，最新研究显示，气管、肺实质与肺血管的炎症反应及结构重塑是COPD的典型病理变化〔2〕。而高迁移率族蛋白(HMG)B1广泛参与COPD患者的多条信号通路中〔3〕，且HMGB1的表达在COPD中的意义不仅在于促进炎症反应，也在于其可以引起气道平滑肌纤维化，与气道和血管重塑，与肺气肿和气流受限也息息相关〔4，5〕。根据最新的研究，血清基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9同样伴随COPD患者疾病的进行性发展而变化〔6，7〕。虽然HMGB1与MMP-2、MMP-9均与COPD关系密切，且三者之间的相互关系已在其他疾病中被频频证实〔8〕，但在COPD中的变化机制尚不明确。本研究小组已证实二陈汤加味可通过多条信号通路协同来抑制COPD的炎症反应，并阻止气道重塑〔9～19〕，因此本研究选取HMGB1与MMP-2、MMP-9为研究对象，为二陈汤加味对COPD的多靶点治疗作用提供依据。

1 材料与方法

1.1动物 清洁健康的SD大鼠雄性70只，SPF级，2月龄，体重(200±20)g，合格证号SCXK(鲁)20140007，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供；实验场地河南省中医药研究院动物实验中心，许可证号SYXK(豫)2012-0009；动物实验伦理审查批准编号DWLL20130018。生长饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，许可证号苏饲证(2014)01008。

1.2药物及试剂二陈汤加味方组成 姜半夏10 g(批号1505001S)、茯苓20 g(批号1405002W)、陈皮10 g(批号1509002S)、白术15 g(批号1407001W)、党参25 g(批号1407007W)、枳壳10 g(批号1510002W)、山药20 g(批号1509003S)、地龙10 g(批号1511002S)、桂枝3 g(批号1510002S)、炒苏子20 g(批号1512001S)、炙麻黄6 g(批号1508001S)、杏仁10 g(批号1404002S)、葶苈子15 g(批号1506001W)，均为中药配方颗粒，购自华润三九医药公司。脂多糖(美国Sigma公司，025M40400V)；大鼠MMP-2酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉博士德公司，EK0639)，大鼠MMP9 ELISA试剂盒(武汉博士德公司，EK1463)，兔多抗HMGB1(武汉三鹰公司，10829-1-ap)，兔多抗GAPDH(杭州贤至公司，AB-P-R 001)，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗(武汉博士德公司，BA1054)。红旗渠过滤嘴香烟，购自河南中烟工业有限责任公司。其他试剂均由河南中医药大学科研实验中心提供。

1.3仪器 实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，DL-5-B离心机(上海安亭仪器厂)，TWCL-B140×140调温、恒温磁力搅拌器(巩义予华公司)，BA210生物显微镜(厦门麦克奥迪公司)，BSA124S-CW万分之一电子天平(北京麦多利斯公司)，ZWY240恒温培养振荡器(上海智诚公司)，DB-B1烤片机(常州国华公司)，微量分光光度计(杭州奥盛公司)，SW-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰公司)，EG1150C冷台，RM2245半自动轮转式切片机，TP1020-1自动组织脱水处理机，ST5020全自动染色机，HI1210烘片机(均购自上海徕卡公司)。

1.4分组、模型制备与给药 随机将70只SD大鼠分为7组：即正常组、模型组、二陈汤加味低、中、高剂量〔10、20、40 g/(kg·d)〕、二陈汤组、消咳喘组。除正常组外，其余各组制备COPD的大鼠模型〔13～15〕，并于第1天、第14天，对70只大鼠进行逐一麻醉(麻醉方法为腹腔注射10%水合氯醛溶液，给药量为0.03 ml/kg)，除正常组外皆于气管滴注LPS(给药量为1 mg/ml)0.2 ml。正常组则在气管内注入等量生理盐水。第2～45天将需造模的大鼠置入自制密封的烟熏箱内，被动吸烟，进行烟雾染毒，2次/d，香烟10支/次，30 min/次，间隔4 h。最终以肺功能的改变和病理组织为标准判断模型是否制备成功〔16〕。模型制备成功之后，对各组大鼠进行灌胃，各组大鼠每日用药分别按照二陈汤加味低、中、高剂量组每日10、20、40 g/kg换算出免煎颗粒用量，用纯水稀释后于每天10 AM及4 PM分别灌胃给药。模型组和正常组灌胃相同体积的纯水，给药全程持续14 d。备注：灌胃剂量换算：二陈汤加味中剂量组用药量按照体重70 kg的成年人每日常规服用药量换算，公式：(动物体重/人的体重)×人用药量×6.3计算，即体表面积系数为0.018。确定中剂量后，低、高剂量再依等比数列进行设置〔17〕。

1.5标本制备 ①固定标本：使用4%浓度的多聚甲醛将大鼠右肺上叶组织固定；②脱水：选取1～2 cm厚的右肺上叶组织的横截面置于包埋盒中，并用自动组织脱水机脱水；③石蜡包埋和切片：手动在石蜡包埋机上完成石蜡包埋，并保存在4 ℃环境下，6 μm厚切片。

1.6ELISA测定肺组织中MMP-2、MMP-9含量 分别设标准孔、空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μl，余孔分别加待测样品100 μl。覆膜，37 ℃，90 min。弃去液体并甩干，每孔加入抗体工作液100 μl，覆膜，37 ℃，1 h。弃去液体，洗板3次，每次浸泡30 s，350 μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。加ABC工作液100 μl，覆膜，37℃，30 min。弃去液体，甩干，洗板5次。每孔加显色剂90 μl，酶标板覆膜，37℃，避光孵育15 min。加终止液100 μl，此时蓝色转黄色。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)，并经转化，计算出MMP-2、MMP-9的实际浓度。

1.7Western印迹检测HMGB1的蛋白表达 取新鲜的冰冻组织100 mg置于容量为2 ml匀浆器中，剪碎肺组织，添加裂解液，裂解30 min，并移入离心管，离心之后取上清液分装、稀释。将稀释样品放置于96孔的板内，按比例为50∶1的比例将二喹啉甲酸(BCA)试剂盒中A液与B液混合，加入96孔板内，避光并孕育30 min，根据标准蛋白浓度与相应的OD值计算直线回归方程。取蛋白样品，凝胶电泳，转膜GAPDH(200 mA 90 min)、HMGB1(200 mA 120 min)。5%脱脂奶粉封闭，加入一抗HMGB1，GAPDH (1∶1 000)，4℃静置过夜。洗涤3次，加入二抗(1∶50 000)，25℃孵育1 h，PBS洗涤5次；电化学发光(ECL)显色曝光。晾干胶片并扫描，用BandScan分析胶片灰度值。

1.8统计学处理 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1大鼠一般情况 实验结束时，正常组大鼠毛皮仍然呈白色并有光泽、呼吸均匀、反应迅速。模型组大鼠呼吸浅快，呼吸困难，易烦躁激惹，毛发干燥发黄，精神差。二陈汤加味高、中、低剂量组分别以相应的药物灌胃后，大鼠体重增加，改善最显著的是二陈汤加味中剂量组。二陈汤加味低剂量组在动物实验进行期间死亡1只，模型组死亡2只，经解剖观察，发现肺气肿及肺部感染可能是致死的主要原因。

2.2大鼠肺组织匀浆液中MMP-2、MMP-9的浓度 与正常组比较，模型组大鼠肺组织匀浆液中MMP-2、MMP-9浓度显著升高(均P<0.05)；与模型组比较，二陈汤加味低、中、高剂量组MMP-2、MMP-9浓度均有程度不等的降低(均P<0.05)。见表1。

2.3大鼠肺组织中HMGB1蛋白表达 与正常组肺组织HMGB1蛋白表达量(0.52±0.02)比较，模型组肺组织中HMGB1蛋白表达显著上升(1.02±0.02，P<0.05)，与模型组比较，二陈汤加味低(0.82±0.04)、中(0.59±0.02)、高剂量组(0.69±0.01)、消渴喘组(0.69±0.02)、二陈汤组(0.84±0.04)HMGB1蛋白表达均有程度不等的降低(P<0.01，P<0.05)。见图1。

表1 各组肺组织匀浆MMP-2、MMP-9的浓度比较

1～7：正常组、模型组、二陈汤加味低剂量组、二陈汤加味中剂量组、二陈汤加味高剂量组、消渴喘组、二陈汤组

3 讨 论

COPD归属中医“肺胀”、“喘证”、“咳嗽”等范畴。其病机为本虚标实，且以肺气虚为本，痰气交阻为标。其症状多以进行性加重的咳、痰、喘、闷为主，而二陈汤作为历代公认的祛痰之祖方，以理气化痰，燥湿和胃为主要功效，方中半夏和胃降逆、燥湿化痰，姜制后更适用于寒痰咳逆及脾虚痰盛；陈皮健脾理气，茯苓淡渗利水皆可裨益化痰之力，甘草润肺止咳、健脾和中、调和诸药，全方配伍精当，为历代医家所推崇。如《活人书》讲道“二陈汤，治痰之准绳也”，汪昂《本草备要》谈道“治痰通用二陈”，陈念祖提出“此方为痰饮之通剂也”，本研究结合临床实际和历代医家论述，将二陈汤在原方的基础上适当增补，以求针对COPD痰气交阻之巢穴，且根据研究发现，历代在使用二陈汤时皆以二陈汤的加味运用为主，即便是当年的实验研究亦是如此〔20〕。因此本研究的二陈汤加味，再加炒苦杏仁、蜜炙麻黄以止咳平喘、宣降肺气，两者一升一降，恰可通畅气机之滞涩，又加葶苈以降逆泻肺，白术、党参、山药以补肺健脾，寓意培土生金，不离“治病必求其本”之大法；因长期痰气交阻，气机滞涩，血脉为之而不通，淤塞由之而显著，故加地龙以通络祛瘀。诸药并用，止咳平喘、燥湿化痰、通络止痛，使肺气得宣，脾气得旺，肾气得固，不仅可消弭病痛于无形，更可培护根本。

HMGB1属于重要炎症因子，且在COPD患者的肺组织和气道中高表达。巨噬细胞、单核细胞等在受到刺激之后会在16～20 h释放HMGB1，且HMGB1在血清中能够维持1～3 d，在COPD患者中，HMGB1在COPD患者中有重要的意义〔21〕。因其不仅可以广泛参与到肺部炎症反应中，更与气道重塑和纤维化息息相关〔22〕。HMGB1还能够促进炎症细胞积聚，并促进炎症反应加深，进而对肺组织造成损伤〔23〕，因此不仅可以作为研究肺疾病的理想指标，更是判断预后、评价病情的客观指标〔24〕。MMPs，是对肺组织的基质降解和重塑有重要调节作用的蛋白，其中MMP-2、MMP-9可作用于气道细胞外基质膜和基质之上，使细胞外基质降解，导致肺组织弹性降低，加快COPD的进展，加重气道的阻塞〔25,26〕。本研究证实，二陈汤加味可通过抑制MMP-2、MMP-9的合成与分泌，降低COPD大鼠肺组织中MMP-2、MMP-9的含量，从而达成对COPD大鼠肺组织炎症的治愈作用；通过降低大鼠肺组织中HMGB1的蛋白表达，从而使细胞外基质的沉积减缓，减轻了COPD大鼠肺组织的重构。