乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白在乙肝病毒感染相关肝细胞癌中的表达及意义

孙龙 苏健 邓杨柳 黄圣楷 符微

(海南医学院第一附属医院感染科，海南 海口 570102)

肝细胞癌(HCC)在全球恶性肿瘤发病率中列第6位，每年新发的HCC及其死亡病例有50%以上发生在中国〔1〕，中国HCC发病率居恶性肿瘤第4位，病死率居恶性肿瘤第3位〔2〕。乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起HCC的最主要原因，超过80%的HCC与HBV感染相关〔3〕。HCC早期症状多不明显，临床诊断困难，病人就诊时往往已是进展期，甚至全身广泛转移，已错过最佳治疗时机，预后差。因此，寻找特异性好、诊断价值高的标志物及有效的治疗靶点，是目前研究HCC的主要热点之一。乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白(HBSP)在慢性HBV感染患者中十分常见，可影响肝细胞功能，具有重要的致病意义〔4〕。本研究观察HBSP在HBV感染肝脏疾病中的表达变化，并探讨其对HCC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1病例资料 选取2018年7月至2019年12月海南医学院第一附属医院门诊及疗区的HBV感染相关疾病患者152例，其中慢性HBV携带者(CHBC)40例，男23例，女17例，平均年龄(38.8±15.2)岁；慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者42例，男30例，女12例，平均年龄(43.8±10.6)岁；肝硬化(LC)患者38例，男27例，女11例，平均年龄(48.5±12.7)岁；HCC患者32例，男25例，女7例，平均年龄(45.6±16.2)岁。所有患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》、《原发性肝癌防治指南(2011年版)》相关诊断标准，就诊前均未接受抗HBV治疗，性别、年龄无统计学差异(P>0.05)。

1.2分析方法 静脉采血、分离血清，采用荧光定量检测HBV-DNA水平；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测甲胎蛋白(AFP)、AFP异质体(AFP-L3)、AFP-L3%水平；实时定量PCR检测HBSP水平。病毒DNA提取试剂盒，QIAamp MinElute Virus Spin产品；HBSP上游引物：CCGCGTCGCAGAAGATCT；下游引物：ATGGGAATACAGGTGCAATTTCC和HBSP标准品(HBSP全长506 bp)引物由广州天一辉远基因科技有限公司合成并纯化。

实时定量PCR检测HBSP：取200 μl血清样本，使用病毒DNA提取试剂盒提取血清病毒 DNA作为模板，采用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法实时定量PCR专用试剂TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(KaTaRa，日本)，用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪进行检测。反应体系为25 μl：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl、上游引物和下游引物(20 pmol/L)各1 μl、DNA模板2 μl和8.5 μl灭菌超纯水。扩增条件为95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 10 s，39个循环，熔解曲线绘制从 65℃到 95℃。反应结束后确认扩增曲线、熔解曲线并记录Cq值，进行检测方法学评估及实验分析。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0及 GraphPad Prism6 软件行单因素方差分析、Kruskal-WallisH检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1各组血清HBSP水平(cq值)比较 与CHBC组(29.81±5.34)比较，CHB组(31.74±5.66)、LC组(34.73±4.11)及HCC组(39.94±3.79)组血清HBSP的Cq值均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，HCC组>LC组>CHB组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2各组HBV-DNA水平比较 与CHBC组(7.35±0.48 log10IU/ml)比较，CHB组(4.34±0.35 log10IU/ml)、LC组(4.57±0.24 log10IU/ml)及HCC组(4.39±0.21 log10IU/ml)血清HBV-DNA水平均明显降低(P<0.01)，LC、HCC组血清HBV-DNA水平明显低于CHB组(P<0.05)，而两组LC、HCC无统计学差异(P>0.05)。

2.3各组血清AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比较 血清AFP水平方面，与CHBC组比较，HCC组、CHB组及LC组均明显升高(P<0.05,P<0.01)，且HCC组>CHB组>LC组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，但HCC组AFP水平相差较大，部分患者完全正常。血清AFP-L3、AFP-L3%水平方面，与CHBC组比较，LC组升高(P<0.05)，而HCC组明显升高(P<0.01)，且明显高于CHB、LC组(P<0.01)，见表1。

表1 各组血清AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比较

2.4相关性分析 各组血清HBSP水平与血清HBV-DNA、AFP无明显相关性(P>0.05)，与AFP-L3、ALP-L3%水平呈一定效应关系，呈正相关(P<0.05或P<0.01)，见表2。

表2 血清HBSP水平与HBV-DNA、AFP、AFP-L3、AFP-L3%相关性(r/P值)

3 讨 论

目前，针对HCC临床诊断、早期筛查临床上应用最为广泛的AFP在转录水平上受多种因素调控，CHB、LC患者也可出现低-中度升高，而部分低分化型HCC患者正常，其特异性并不理想。AFP-L3仅由肝癌细胞分泌产生，与影像学比较，对HCC早期诊断有9～12个月提前时间〔5〕，血清AFP-L3%、AFP-L3阳性率与癌灶大小、肿瘤分期呈正相关，对于判断HCC的肿瘤病理学特性具有一定意义〔6〕，在AFP浓度<200 ng/ml时，AFP-L3%对HCC的确诊具有重要的临床意义〔7〕。维生素K缺乏或拮抗剂-Ⅱ诱导蛋白(PIVKA-Ⅱ)是诊断HCC的另一个重要指标，可与AFP互补〔8〕，联合AFP可提高HCC检出率，且在HCC发生、发展过程中有一定的优势，可用于监测病情变化〔9〕。但由于多种条件限制，AFP-L3、AFP-L3%及PIVKA-Ⅱ在临床实际工作开展并不多，目前对于HCC的临床诊断仍然主要依赖于AFP、影像学和肝活检，尚缺乏具有高度特异性的实验室检测指标，早期临床诊断依旧相对比较困难。众所周知，慢性HBV感染是LC、HCC最主要原因，我国77.22%的LC患者由HBV感染引起〔10〕，超过84%的HCC患者与HCC相关〔11〕。早期研究认为，HBV基因变异是CHB病程发展方向的重要决定因素〔12〕。HBV基因组剪接变异体与HBV的持续性感染和致病性存在密切关系〔13～15〕。HBSP可影响肝细胞骨架的重塑、细胞内物质代谢等方面，与肝细胞的增生、迁移及代谢异常密切相关，可能在HBV感染发病机制中具有重要作用〔16〕。在HCC确诊前HBSP有明显增加，提示血清HBSP或许可以成为一个预测HCC发生的有效手段〔17〕。另有研究结果提示，HBSP介导的HCC细胞或原代人肝细胞(PHH)对激动性抗Fas抗体(CH11)或FasL诱导的细胞凋亡具有抗性，表明HBSP通过增强PI3K/Akt活性来防止Fas诱导的肝细胞凋亡，可能有助于慢性感染过程中被感染肝细胞的存活和持久性〔18〕。

本研究结果提示HBV引起的反复免疫应答反应致HBV-DNA低表达，不能完全清除或有效抑制HBV，肝脏炎症反复发生，是肝细胞损伤的主要机制，是进展为LC、 HCC 的重要因素。AFP影响因素较多，肝脏炎症明显时肝细胞再生可致血清AFP 升高，而部分低分化型HCC血清AFP正常，临床诊断HCC的特异性下降。血清AFP-L3、AFP-L3%对于HCC更具临床诊断意义，与相关报道一致〔5～7〕。另外，本研究结果提示HBSP与HBV感染相关肝脏疾病关系密切，可能是HCC独立影响因素，具有一定的临床诊断价值。

综上，HBSP水平在HBV感染相关HCC中表达升高，在其发病机制中可能具有重要作用，特别是对HCC的临床诊断、早期筛查或许具有重要意义。至于HBSP参与HBV感染相关肝脏疾病(特别是HCC)的确切机制，能否成为HCC新的、特异性好、诊断价值高的检测指标，或成为HCC有效的治疗靶点，还有待进一步研究。