香烟烟雾刺激诱导肺动脉高压动物模型的构建

孙得胜 刘虹延 刘先胜 欧阳瑶

(遵义医科大学附属医院 1呼吸与危重症医学科，贵州 遵义 563003；2针灸科；3华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科 卫生部呼吸系统疾病重点实验室)

肺动脉高压作为常见的肺血管疾病，以显著的肺动脉压增高为主要特征，它也是多种慢性呼吸系统疾病的并发症及多种疾病发生、发展的关键环节。另外，它也是相关疾病患者病情加重和死亡的重要原因之一。作为常见的肺血管疾病，肺动脉高压的特点是肺动脉及右心室收缩压力增高，常常引起右心功能不全，预后很差〔1～5〕。 它往往存在着肺远端小血管的重塑，并因此引起血管阻力升高，常伴右心室肥大，甚至造成严重的右心力衰竭〔6,7〕。吸烟者容易发生肺动脉高压〔8〕，而且有研究显示〔9～11〕，不少吸烟的慢性阻塞性肺疾病患者在患病初期，未发生明显缺氧时已存在肺小血管重塑。从而说明香烟烟雾能够直接造成肺小血管重塑〔9〕。构建有效的肺动脉高压疾病模型是深入研究肺动脉高压的发病机制，并进一步为临床工作提供参考依据的前提。 在大鼠肺动脉高压模型实验中，通常采用低氧干预、野百合碱诱导及外科操作分流等方法。本研究以单纯香烟烟雾刺激4个月的方法建立疾病模型，以右心导管的方法检测大鼠血流动力学指标、取肺组织制作病理切片来检测肺血管重塑程度等方法，旨在研究和探讨这一种方法制作肺动脉高压疾病模型的可行性，为今后深入探讨肺动脉高压的发病机制提供研究平台。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级SD雄性大鼠(共20只)，鼠龄8 w，体重200～220 g，从武汉同济医院实验动物中心购买。造模、测压及取材等操作在武汉同济医院实验动物中心内进行。

1.2主要仪器与试剂 香烟烟雾暴露染毒系统(自主研发，专利号ZL201820234399.3)；PowerLab 生物数据分析系统(ADInstruments公司)；石蜡切片机(MEDITE公司)；4℃低温冰箱(中国海尔公司)；Motic image图像系统(麦克奥迪有限公司)；香烟(烟碱量0.6 mg、焦油含量9 mg、一氧化碳量11 mg 湖北中烟工业有限责任公司)；多聚甲醛(塞维尔公司)；苏木素染液(塞维尔公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，拜意尔生物公司)。

1.3实验方法

1.3.1模型的建立 把大鼠用随机数字表法分为：对照组(n=9)和肺动脉高压模型(模型)组(n=11)。肺动脉高压模型组大鼠在染毒箱〔12〕内接受香烟烟雾暴露，每天2次，连续造模4个月。监测染毒箱里面的氧气浓度，控制箱内氧气浓度在18%～21%。同时，使染毒箱里面的一氧化碳浓度维持在900 ppm左右。满4个月时检测右心室收缩压，然后取肺组织并进一步制作病理切片，检测肺血管重塑程度。

1.3.2检测血流动力学指标 参考相关文献的方法进行〔13，14〕。常规麻醉大鼠后，行气管插管，连接小动物呼吸机机械通气。设置好潮气量、呼吸频率等参数后，剪开大鼠体表皮肤及皮下组织后，以右心导管测压，待示波波形稳定后，由PowerLab 软件分析。

1.3.3计算右心室肥厚指数 将大鼠心室中的血液放尽后，将心脏分离为右心室、左心室+室间隔两部分，在干燥程度基本一致的条件下称量，并计算心室肥厚指数。比较两组间的右心室重量的差异。

1.3.4肺组织标本留取及检测 将大鼠的右肺上叶以多聚甲醛固定，并进一步制作石蜡切片，进行苏木素-伊红(HE)染色以中膜厚度的差异比较两组大鼠的肺血管重塑程度。所有独立的实验至少重复3次。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1一般情况 与对照组相比，模型组大鼠活动减少，毛发较为枯黄。造模过程中，模型组死亡3只，对照组有1只大鼠肺组织切片见严重肺炎征象，因此未纳入分析。

2.2右室收缩压 与对照组相比，模型组右心室收缩压显著增高。参考国际上的研究共识〔1,5,15〕，可认为本实验中肺动脉高压模型成立。见图1、表1。

图1 右室收缩压波形图

表1 两组各指标比较

2.3右心室肥厚程度 模型组大鼠的右心室重量、右心室重量/体重和右心室肥厚指数，均比对照组明显升高，提示模型组大鼠的右心室肥厚程度明显加重。见表1。

2.4肺血管重塑的观察 将HE切片放大200倍，观察那些直径在50～150 μm的血管。以中膜厚度比作为衡量指标，模型组肺血管管壁的厚度显著增加。见表1、图2。

图2 肺血管重构水平(HE，×200)

3 讨 论

肺动脉高压的发病机制目前尚不清楚，它分为五大类，不同类的肺动脉高压在病因和诊疗方法也有许多差异。在肺动脉高压的研究领域，目前常用的动物造模方法主要有野百合碱诱导、缺氧诱导(联合或不联合SU5416)、手术分流等方法〔15～19〕。随着烟草相关疾病越来越受到关注，香烟烟雾能否直接引起肺动脉高压成为该领域的研究热点〔9,20〕

既往研究多注意到长期吸烟者存在慢性缺氧，而缺氧可引起肺血管收缩和肺血管重构，从而认为此情况下肺动脉高压的发生是继发或伴发于慢性阻塞性肺疾病〔21〕。然而，不少研究发现，香烟烟雾的刺激功能能够在不缺氧时，直接造成肺血管的重构，继而参与疾病的发生和发展〔9～11〕。

在本研究中使染毒箱氧气浓度维持在18%～21%，和空气中的氧浓度接近，因此可排除环境缺氧这一因素对本模型的影响。本研究发现，经单纯的香烟烟雾作用4个月后，大鼠的右心室收缩压明显升高，右心室收缩压在科研中常用来反映肺动脉收缩压，故表明该模型顺利造成。肺动脉高压组的右心室肥厚程度显著加重，肺血管重塑水平也明显增加，提示以香烟烟雾刺激的方法建立的肺动脉高压动物模型中，肺动脉高压的形成可能与肺血管重塑及右心室肥厚有关，具体的机制尚待进一步研究。