亢璐 郑瑞 杨智航 张晋宁 王雪倩 陶艺
(沈阳医学院 1生理学教研室,辽宁 沈阳 110034;2 2015级临床9班)
由意外和突发原因导致的暴力撞击,常引起创伤性脑损伤(TBI),造成血脑屏障(BBB)结构损伤和功能失调。创伤会引起脑组织内的脂质过氧化物含量明显增加,还原性物质如维生素C、E减少及清除自由基的酶类物质活性下降,使氧自由基、花生四烯酸代谢产物作用于脑微血管内皮细胞的脂质膜,破坏BBB完整性,提高渗透率,造成脑组织水肿,引起颅内压升高,甚至脑疝而危及生命〔1,2〕。银杏叶提取物(EGb761)其主要成分银杏黄酮具有强大的抗氧化与清除自由基的能力,可以在抗炎、扩张血管、改善外周循环等方面发挥药效,广泛用于心脑血管、神经等系统疾病的防治和保健〔3〕。本研究通过给予创伤性脑损伤大鼠不同剂量的EGb761,探讨其对创伤局部脑水肿的作用及可能机制。
1.1实验动物及分组 实验动物购自辽宁长生生物技术股份有限公司,许可证号:SCXK(辽)2015-0001;健康成年SD大鼠64只,雌雄不限,体重200~250 g,采用随机单位设计法将SD大鼠分为4组各16只:A组:假手术组;B组:TBI+等剂量生理盐水组;C组:TBI+低剂量EGb761(25 mg/kg)组;D组:TBI+高剂量EGb761(50 mg/kg)组。实验动物单笼饲养,12 h明暗循环,自由饮水进食,温度(22±4)℃,相对湿度(50±4)%。
1.2主要试剂 EGb761注射液(台湾济生化学制药厂股份有限公司);β-actin单克隆抗体、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)多克隆抗体(美国Proteintech公司)、血管内皮生长因子(VEGF)受体(VEGFR)2多克隆抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-9多克隆抗体(武汉云克隆科技股份有限公司);丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)1多克隆抗体(美国Affbiotech公司);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司);超氧化物阴离子荧光探针(DHE)(美国Sigma公司)。
1.3仪器 光学显微镜(德国Lecia公司);生物组织脱水机(湖北孝感阔海医疗科技有限公司);生物组织包埋机(湖北泰康医疗设备有限公司);生物组织摊烤片机(湖北慧达仪器有限公司);酶标仪(德国BMG labtech公司);Omega Lum C仪(美国Aplegen公司);大鼠脑立体定位仪重力打击器(北京众实迪创科技发展有限公司)。
1.4颅脑创伤动物模型的建立 大鼠称重后,按0.3 ml/100 g给予10%水合氯醛麻醉,剃毛器备皮,碘伏消毒,俯卧位将鼠头固定于脑立体定位仪,颅骨正中线切开头皮2~3 cm,骨膜剥离干净,充分暴露右顶骨,根据Feeney自由落体致伤法,以中线右旁3 mm,冠状缝后3 mm处为圆心,用颅骨钻开直径5 mm骨窗(硬脑膜完整),其上放置配套金属垫片,40 g重锤从金属垫片上方25 cm沿套管自由落下撞击,造成大鼠颅脑损伤〔4〕。而后用适量骨蜡封闭骨窗,缝合头皮,碘伏消毒,大鼠后腿肌注青霉素。假手术组大鼠不做重锤撞击,其余操作相同。
1.5EGb761给药方法 根据EGb761的临床人体用量,按等效剂量系数折算法换算大鼠的等效剂量。在TBI伤后1 h,C组和D组大鼠分别按25 mg/kg和50 mg/kg腹腔注射EGb761,A、B组给予相同体积生理盐水,连续给药3 d。
1.6干湿重法测大鼠脑组织含水量 各组大鼠造模72 h后断头,分离损伤侧脑组织,应用电子天平精确称量湿重(Ww),而后将其放于烤箱内,100℃烤24 h,应用电子天平精确称量干重(Dw),按Elliott公式:脑组织含水量(%)=(Ww-Dw)/Ww×100%,计算脑组织含水量。
1.7DHE染色实验 石蜡切片经烤片及脱蜡,DHE用二甲基亚砜(DMSO)溶解,制成10 μmol/L的溶液,将DHE工作液滴加于切片,4℃过夜,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后,滴加适量抗荧光淬灭封片剂,共聚焦显微镜下拍照,Image J软件分析荧光强度。
1.8Western印迹检测VEGFR2、PI3K、Akt1和MMP-9表达水平 各组大鼠造模72 h后断头,取损伤灶周围脑组织约100 mg剪碎,加入总蛋白提取液,用组织匀浆机匀浆,4℃下震荡离心后取上清液,精确蛋白定量。各样本等量总蛋白经SDS-PAGE分离,电转移到硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉封闭;加入VEGFR2(1∶200)、PI3K(1∶500)、Akt1(1∶500)、MMP-9(1∶200)、β-actin(1∶1 000)特异性抗体,4℃孵育过夜;TBST清洗3次,各5 min,加入羊抗兔二抗(1∶2 000倍稀释)室温下孵育2 h,TBST清洗3次,各5 min,滴加ECL化学发光液,使用Omega Lum C仪显影,Image J软件分析目的蛋白条带与内参β-actin条带灰度比值,代表目的蛋白的含量。
1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件进行方差分析、SNK法。
2.1干湿重法测脑含水量 与A组(77.06±0.22)%相比,损伤72 h后,B组损伤侧脑组织含水量(81.34±0.35)%、C组(79.62±0.15)%和D组(78.53±0.12)%,明显升高(n=6,P<0.05);与B组相比C组和D组损伤侧脑组织含水量显著降低(P<0.05);D组损伤侧脑组织含水量显著低于C组(P<0.05)。
2.2氧自由基在大脑皮质的表达 A组大鼠脑皮质中DHE染色的平均荧光强度为(1.65±0.23),与之相比,B组(2.97±0.17)、C组(1.82±0.10)和D组(1.76±0.20)平均荧光强度均显著增高(n=4,P<0.05);C组和D组平均荧光强度显著低于B组(P<0.05),且D组较C组平均荧光强度降低更为显著(P<0.05)。见图1。
2.3VEGFR2、PI3K、Akt1和MMP-9在大脑皮质中的表达 B、C和D组VEGFR2、PI3K、Akt1、MMP-9蛋白表达水平显著高于A组(P<0.05);与B组相比,C组和D组的VEGFR2、PI3K、Akt1和MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05);且D组各蛋白表达水平显著低于C组(P<0.05)。见表1、图2。
图1 各组大鼠大脑皮质DHE染色结果(×400)
表1 EGb761对大鼠脑组织中VEGFR2、PI3K、AKT1、MMP-9蛋白表达的影响
图2 EGb761对大鼠脑组织中VEGFR2、PI3K、AKT1、MMP-9蛋白表达的影响
TBI引起脑组织水肿的本质,是内皮细胞间的连续性中断(细胞旁途径)和内皮细胞的胞饮小泡增加(跨细胞途径),使毛细血管通透性增加〔5〕。TBI后创伤区脑含水量在伤后1 h已开始升高,水肿高峰出现于24~72 h,随后逐渐下降〔6〕。TBI后1 h给予EGb761处理的C、D组大鼠脑水肿程度减轻,且呈剂量依赖性。
VEGF促进血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成,增加血管通透性〔7〕。VEGF的过度表达是TBI后血脑屏障崩溃,引发脑水肿及其他严重并发症的常见原因之一〔8〕。VEGF通过激活VEGFR2,在抑制视网膜微血管内皮细胞的通透性和脉络膜血管生成活性中发挥关键作用〔9〕。以往研究证明,VEGF刺激VEGFR2的磷酸化,导致Akt的激活,并增加内皮一氧化氮合酶(eNOS)和细胞外调节激酶(ERK)1/2的磷酸化,PI3K在VEGF/VEGFR-2信号通路中作用于Akt-eNOS上游〔10〕。VEGF通过与VEGFR2结合,进而激活细胞内PI3K/Akt和ERK1/2信号通路,促使人脑微血管内皮细胞中EphA2的表达,这有助于通过细胞旁途径,增加人脑微血管内皮细胞通透性〔11〕。PI3K通过多种神经递质和生长因子激活后,Akt在Thr308和Ser473位点磷酸化,通过合成或释放MMPs,调控内皮细胞增殖迁移和血管通透性〔12〕。在糖氧剥夺离体脑缺血模型中,非肌肉肌球蛋白重链ⅡA可以通过激活本研究Toll样受体(TLR)4/PI3K/Akt JNK1/2/14-3-3ε/NF-κB/MMP9通路,下调紧密连接相关蛋白,导致其功能紊乱,BBB通透性增加〔13〕。上述结果与本研究结果相一致,提示TBI可引起VEGF上调,与VEGFR2结合后,激活VEGF/PI3K/Akt1通路,上调MMP-9的表达水平,紧密连接通透性增加,导致脑水肿加重。
正常生理条件下,氧气分子是稳定的双原子结构,在受创伤、缺氧、紫外线等因素影响下,氧原子便会失去一个电子,由无害的氧变成非常活跃的具有杀伤力的氧自由基,它与多种物质发生作用,对细胞极具破坏性,常引起一系列连锁反应,使新陈代谢紊乱〔14〕;通常机体产生的少量氧自由基,可被体内的抗氧化剂(如脂溶性的维生素E、水溶性的维生素C,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等)通过氧化还原反应彻底清除〔15〕。但TBI诱导大量氧自由基产生时,可直接激活MMPs,下调紧密连接相关蛋白,上调水通道蛋白,导致BBB通透性增加,促进脑水肿〔16〕。本研究结果印证了这一事实。EGb761是通过特定的工艺和标准从干燥的银杏叶中提取的具有多种有效药用成分的混合物,具有抗炎、抗氧化、改变血液流变学、抗血小板聚集、参与免疫调节和神经保护作用〔17〕。银杏黄酮是EGb761的有效成分之一,具有强大的抗氧化和清除自由基能力,其通过清除超氧离子、羟自由基和脂质过氧化自由基等,减少脂质过氧化物的生成与沉积,阻断或终止自由基连锁反应链,提高超氧化物歧化酶的活性,有效拮抗自氧由基对不饱和脂肪酸的破坏,阻止或抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应引起的病理性损伤〔18〕。奥拉西坦联合EGb761可以安全有效地降低急性脑出血患者的脑水肿量,改善神经功能〔19〕。本研究结果提示EGb761能够有效缓解脑水肿,与其清除氧自由基的药效有关。关于血管内皮细胞生长抑制剂(VEGI,也被称为TNFSF15)的研究发现,TBI可导致实验动物BBB的破坏,损伤组织中VEGF/VEGI比值急剧升高。若在TBI早期给予VEGI,能够下调VEGF的表达,抑制VEGFR2的激活,显著降低血脑屏障通透性,恢复正常的VEGF/VEGI比值,同时可持续观察到水肿减轻,神经元细胞死亡减少,神经功能改善〔8〕。噻唑烷二酮类药物(罗格列酮)通过激活PI3K-Akt或-PKC,促进人脐静脉血管内皮细胞迁移和调节通透性;同时罗格列酮增加了VEGF的表达,抑制了紧密连接蛋白〔连接黏附分子(JAM)-A和闭锁连接蛋白(ZO)-1〕的表达,促进血管渗漏,引起周围组织水肿;应用Akt抑制剂后,上述现象减弱〔20〕。本实验结果提示EGb761可能具有类似作用,可以抑制VEGF/PI3K/Akt1信号通路,下调MMP-9表达,通过促进微血管的形成,改善BBB通透性,从而缓解创伤引起的脑水肿,为提高TBI疗效提供新的思路。