检验用大肠杆菌K88纤毛抗原的纯化及其单因子血清制备与质量控制方法研究

彭国瑞， 蒋 菲， 王秀丽， 彭小兵， 李 建， 李旭妮， 李俊平， 张 媛

(1.中国兽医药品监察所， 北京海淀100081 ； 2.中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193 ； 3.中国动物疫病预防控制中心， 北京大兴102600)

目前，我国用于预防仔猪黄痢的疫苗有仔猪大肠埃希菌病三价灭活疫苗和仔猪大肠杆菌病(K88、K99、987P)、产气荚膜梭菌病(C型)二联灭活疫苗等，年产量约380万头份。这类疫苗的效力检验主要采用反向间接血凝试验(RIHA)测定大肠杆菌K88、K99和987P纤毛抗原的RIHA效价，该方法需使用相应纤毛抗原单因子血清[1]，国外采用的ELISA方法也需要纤毛抗原多克隆抗体和单克隆抗体[2]。但现有方法[3-4]制备这3种单因子血清要求抗原纯度高、免疫抗原剂量大，同时也存在血清效价不易提高、质量不易稳定控制的问题。因此，研究一种效价高、特异性好、制备方法简便、质量可控的纤毛抗原单因子血清标准品，对于提高疫苗检验结果的一致性和稳定性都十分必要。本研究通过高密度发酵获得了仔猪大肠杆菌培养物，优化了K88纤毛抗原的纯化方法，制备了免疫血清，并对制备过程进行质量控制，为兽用生物制品检验用标准品的研制提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 菌种 仔猪大肠杆菌灭活疫苗检验用含K88纤毛抗原的大肠杆菌CVCC196(C83902)，由中国兽医药品监察所保存。

1.2 试剂 改良Minca琼脂、改良Minca肉汤干粉、PBS缓冲液，均由北京中海生物科技公司提供；BCA蛋白定量试剂盒，购自北京康为世纪公司；K88、K99、987P纤毛抗原单因子阳性血清、弗氏佐剂，均由本实验室制备；甘油、柠檬酸、硫酸氨、脱氧胆酸钠(Na-DOC)等为国产或进口试剂纯。

1.3 仪器和设备 生物反应器(Applicon，ez-control & 7 L Autoclavable Bioreactor)、Waring组织捣碎机24CB10、紫外分光光度计(SPECTRA max，384 plus)等。

1.4 实验动物 体重1.5～2.0 kg大耳白兔，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.5 方法

1.5.1 生物反应器发酵培养 将菌种CVCC196划线接种改良Minca琼脂平板，37 ℃培养20 h。选取若干典型菌落接种400 mL改良Minca肉汤，37 ℃ 200 r/min振荡培养16 h，作为发酵种子液。在生物反应器中加入含5%甘油的改良Minca肉汤3.5 L高压灭菌后，设定发酵温度37 ℃，pH 7.0(用氨水调节pH)，搅拌速度500～580 r/min，溶氧120%，通空气量15 L/min，待控制系统稳定后，接种380 mL种子液。以含12.5%葡萄糖、12.5%胰蛋白胨400 mL作为补料液缓慢补料，1 h内补充完毕。取样测定发酵菌液OD600 nm吸光值，用K88单因子阳性血清做平板凝集试检测细菌的生长和纤毛抗原的表达。

1.5.2 K88纤毛抗原的粗提取 将收获的发酵菌液8 000 g离心30 min，弃上清，沉淀用0.01 mol/L pH 7.2的PBS悬浮至原体积，重复离心悬浮3次。加入组织捣碎机，21 500 r/min，3 min/次，间隔2 min， 处理3次以上，取小量样品离心，将沉淀回复原体积，用K88单因子阳性血清做平板凝集试验至离心沉淀弱凝集或不凝集。收集处理后菌液28 000 g离心30 min，弃沉淀，上清即为K88纤毛抗原粗提取物，SDS-PAGE检测。

1.5.3 K88纤毛抗原的纯化 (1)柠檬酸等电点沉淀：取纤毛抗原粗提取物边搅拌边缓慢滴加柠檬酸至pH 4.0，4 ℃静置沉淀16 h，14 000 g离心15 min， 弃上清，沉淀用1/10体积PBS复溶，SDS-PAGE检测；(2)硫酸铵盐析饱和度的确定：在纤毛抗原粗提取物中分别加入室温保存的饱和硫酸铵溶液至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%饱和度，4 ℃静置沉淀16 h，15 000 g离心30 min，弃上清，沉淀用PBS溶解至原体积的1/10，SDS-PAGE检测；(3)柠檬酸与硫酸铵组合纯化：取纤毛抗原粗提取物边搅拌边缓慢滴加柠檬酸至pH 4.0，4 ℃静置沉淀16 h，14 000 g离心15 min，弃上清，沉淀用PBS复溶至原体积，再加柠檬酸至pH 4.0，4 ℃静置沉淀2 h，离心弃上清，沉淀用PBS复溶。所得溶液加饱和硫酸铵溶液至20%饱和度，4 ℃静置沉淀16 h， 15 000 g 离心30 min弃沉淀，测定上清体积，补加饱和硫酸铵溶液至30%饱和度，15 000 g离心 60 min，沉淀用PBS溶解至原体积的1/20；(4)Doc处理与蛋白浓度测定：上述(3)中所得蛋白溶液用0.5% Na-DOC(0.5%DOC-0.05 mol/L pH 7.6 PB)37 ℃透析48 h，14 000 g离心30 min，弃沉淀，上清用0.02 mol/L pH 7.4 PB 4 ℃透析48 h。琼脂扩散试验检测纯化抗原的反应原性，以纯化蛋白为抗原加入琼脂扩散试验中央孔，将K88、K99、987P纤毛抗原单因子血清以及PBS溶液对照加入周围各孔。BCA法测定蛋白质浓度，SDS-PAGE检测蛋白的纯度。

1.5.4 K88单因子血清的制备 (1)免疫程序：取家兔4只，一免浓度为1 mg/mL纤毛抗原蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀乳化后，1 mL/只后肢两足垫内注射免疫；2周后二免，纤毛抗原蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀乳化，1.5 mL/只背部皮下多点注射免疫；一免4周后三免，纤毛抗原蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀乳化，2 mL/只后肢肌肉注射免疫。(2)血清效价测定：免疫前、每次免疫后采血，分离血清，以浓度为1.5 mg/mL K88纤毛纯化蛋白为抗原，测定免疫后血清琼脂扩散效价[5]。

2 结果

2.1 生物反应器发酵培养 生物反应器控制系统启动稳定1 h后接种，7 h内溶氧量保持在96%上下，到7 h取样菌液OD600 nm为2.784，补料后，溶氧量迅速下降，10.5 h左右溶氧量迅速上升(见中插彩版图1)，11 h收获，菌液OD600 nm为14.208，用K88单因子血清做平板凝集试验检测强凝集。结果表明，大肠杆菌高密度生长，K88抗原得到表达。

2.2 K88纤毛抗原的粗提取 机械脱纤处理后，平板凝集试验显示，菌体与K88单因子血清不能凝集；SDS-PAGE检测显示，离心上清含有与预期纤毛抗原分子大小相当的蛋白质(图2)，表明机械搅拌可以使纤毛抗原脱落。

图2 SDS-PAGE分析K88纤毛粗提取物Fig.2 Analysis of K88 crude extract by SDS-PAGEM：蛋白质marker； 1：K88纤毛粗提取物M:Protein marker; 1:K88 crude extract

2.3 K88纤毛抗原的纯化

2.3.1 柠檬酸等电点沉淀 取纤毛抗原粗提取物用柠檬酸沉淀后SDS-PAGE检测结果见图3，与图2比较可见柠檬酸沉淀后除去了部分杂质蛋白。

图3 SDS-PAGE分析柠檬酸沉淀K88纤毛抗原Fig.3 Analysis of citric acid precipitation product of K88 by SDS-PAGEM：蛋白质marker； 1：K88纤毛抗原柠檬酸沉淀产物M:Protein marker; 1:K88 precipitation product by citric acid

2.3.2 硫酸铵盐析饱和度的确定 10%、20%饱和度硫酸铵对K88纤毛抗原的盐析作用弱，但对杂质蛋白有沉淀作用，30%、40%饱和度硫酸铵对K88纤毛抗原的盐析作用强，50%及以上饱和度硫酸铵会有更多的杂质蛋白与K88纤毛抗原同时沉淀(图4)。因此，采用两步沉淀纯化，首先用20%饱和度硫酸铵沉淀去除杂质蛋白，继续用30%饱和度硫酸铵沉淀K88纤毛抗原蛋白，可达到提纯的目的。

图4 不同饱和度硫酸铵对K88纤毛抗原的沉淀Fig.4 K88 precipitated by ammonium sulfate of different saturationM：蛋白质marker； 1～8：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%饱和度硫酸铵沉淀K88纤毛抗原M:Protein marker; 1～8：K88 precipitated by ammonium sulfate of 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70% and 80% saturation

2.3.3 柠檬酸与硫酸铵组合纯化以及DOC处理 经柠檬酸、硫酸铵组合纯化以及DOC处理后,琼脂扩散试验检测，纯化抗原能够与K88单因子血清发生反应，与K99、987P单因子血清不发生反应。BCA法测定蛋白浓度为1.5 mg/mL。SDS-PAGE检测结果如图5所示，可见1条明显条带，分子大小与K88纤毛蛋白预期大小一致，灰度扫描分析纯度约为85%。

2.4 免疫血清效价的测定 提纯的K88纤毛抗原免疫家兔3次，免疫后采血，琼脂扩散试验测定血清效价，免疫前家兔血清与K88不发生反应，免疫3次后血清效价最高可以达到1∶128(表1)。

3 讨论

对于K88的纯化报道较多的是使用硫酸铵盐析沉淀[3]或结合柱层析[6-7]，或采用等电点酸沉淀结合柱层析[4]等方法，但这些方法或是纯化过程简便，抗原纯度相对不高，或是纯化过程复杂，蛋白纯度高，损失却较大，纯化产率偏低，一定程度上限制了免疫血清制备。本研究通过柠檬酸等电点沉淀和硫酸铵盐析比较发现，单独使用合适饱和度的硫酸铵盐析较柠檬酸等电点沉淀在纯化得率和去除杂质蛋白方面都较为优越[8]，但柠檬酸沉淀可以去除样品体系中硫酸铵盐析沉淀不掉的部分蛋白，基于以上结果，本试验确定第一步采取柠檬酸等电点沉淀，第二步采用20%饱和度硫酸铵梯度盐析沉淀去除杂质蛋白，在提高硫酸铵饱和度到30%沉淀收获目的蛋白，提高了蛋白的纯度和得率，经计算，每升发酵培养菌液能够获得提纯抗原33.3 mg，方法简化，可重复性强，适合大批量纯化。采用SDS-PAGE、蛋白浓度测定和阳性血清琼脂扩散试验对抗原质量进行了控制。

图5 SDS-PAGE分析纯化后的K88纤毛抗原Fig.5 Analysis of purified K88 by SDS-PAGEM：蛋白质marker； 1：BSA； 2：纯化后的K88纤毛抗原M:Protein marker; 1:BSA; 2:Purified K88 citric antigen

表1 家兔免疫血清效价Table 1 Titers of rabbit antiserum

在纤毛抗原制备方法上，除采用传统方法提纯外，用基因工程表达的方法制备重组纤毛抗原已经用于亚单位疫苗，也可以将其应用于免疫血清制备的研究报道[9]。通过基因工程表达和重组蛋白质纯化技术，可以提高纤毛抗原的产量，简化纯化步骤，提高抗原纯度。

由于产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的致病作用与粘附性纤毛和肠毒素密切相关，ETEC菌株是通过纤毛与宿主小肠上皮细胞表面的相应受体结合，从而在该局部组织粘附、定居、繁殖和产生毒素，导致腹泻。引起仔猪腹泻的纤毛抗原主要是 K88、K99、987P 和 F41。纤毛抗原具有良好的免疫原性，免疫机体后能产生相应的纤毛抗体，对产肠毒素大肠杆菌具有免疫作用。因此，可以利用本方法易于大批量纯化的特点，进一步提纯制造疫苗用的纤毛抗原，制成纯度更高，更安全的疫苗。