夹心ELISA法测定基因重组球虫表达异源蛋白的水平

罗伏兵， 徐发荣， 王慧强， 马志军， 汤新明， 刘贤勇， 索 勋， 刘晓冬

(1．北京市动物疫病预防控制中心， 北京大兴102629 ； 2.中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193)

艾美耳球虫(Eimeria)基因组约60 Mbp，可编码8 000～9 000个蛋白，组分复杂[1]。分析异源抗原在基因重组球虫混合组分中所占比重是优化抗原表达水平的基础。常规蛋白定量方法主要是基于蛋白分子间化学键或氨基酸特性等建立的检测蛋白总量的方法，而无法满足检测混合蛋白组分中某一特定/单一蛋白的含量。免疫学检测方法利用抗原抗体特异性的结合反应能够准确检出复杂组分中特定蛋白抗原或抗体，并能实现定量或半定量检测的目的。ELISA是最常用的免疫学检测方法之一，具有操作简便、灵敏度高等优势。本试验以表达荧光蛋白的基因重组球虫为模型，利用荧光蛋白特异性的抗体，建立检测基因重组球虫可溶性蛋白中荧光蛋白含量的夹心ELISA方法，为评估基因重组球虫表达异源抗原的含量和优化其作为疫苗载体的研究提供了科学依据； 同时也为其他类型疫苗载体或相关研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 虫株与试剂 本文所用野生球虫株、基因重组球虫株EtM2e[2]和EtER[3]，均由中国农业大学动物医学院国家动物原虫实验室保存与扩繁。兔源黄色荧光蛋白多克隆抗体(Rabbit polyclonal to GFP,Proteintech)、鼠源黄色荧光蛋白单克隆抗体(Mouse monoclonal to GFP,Beyotime)、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(Proteintech)及BCA蛋白定量试剂盒均为商品化试剂。黄色荧光蛋白对照品系经原核表达、纯化产物，并测定浓度。

1.2 基因重组球虫蛋白提取 球虫可溶性蛋白的提取方法依据参考文献[4]进行。简言之，取新鲜收取并纯化后的EtM2e和EtER球虫株5.0×107个孢子化卵囊，经液氮研磨后，加入适量蛋白裂解液，离心取上清即得球虫可溶性蛋白，BCA法(按照说明书操作)测定球虫蛋白浓度后，置于-20 ℃保存备用。

1.3 包被抗体浓度优化 ELISA方法及所用试剂配制等依据参考文献[4]。简言之，以兔源黄色荧光蛋白多克隆抗体为包被抗体，分别经1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280稀释后，每孔100 μL加入ELISA板中，4 ℃过夜包被。以5%脱脂乳、37 ℃封闭2 h。每孔加入100 μL原核表达的黄色荧光蛋白(2 μg/mL)，37 ℃反应1 h；同时设置空白对照组。每孔加入100 μl鼠源黄色荧光蛋白单克隆抗体100 μL(1∶1 000稀释)，37 ℃反应1 h。每孔加入100 μL HRP标记的羊抗鼠IgG二抗100 μL(1∶5 000稀释)，37 ℃反应1 h后加入TMB显色5 min。终止反应后测定OD450和OD630的吸光度值。以达到最大吸光度值的最大抗体稀释倍数确定包被浓度。

1.4 检测抗体浓度优化 以1.3确定的抗体包被浓度进行包被，封闭后每孔加入100 μL原核表达的黄色荧光蛋白(2 μg/mL)，37 ℃反应1 h；同时设置空白对照组。每孔加入100 μL鼠源黄色荧光蛋白单克隆抗体100 μL(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、 1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000稀释)，37 ℃反应1 h。其他操作同1.3，确定检测抗体浓度。

1.5 检测基因重组黄色荧光蛋白体系的建立与优化 以1.3确定的抗体包被浓度进行包被，封闭后每孔加入100 μL原核表达的黄色荧光蛋白(0、0.001 9、0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.031 2、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL)，37 ℃反应1 h；同时设置空白对照组。每孔加入100 μL鼠源黄色荧光蛋白单克隆抗体100 μL(1.4确定的检测抗体浓度)，37 ℃反应1 h。其他操作同1.3，检测不同浓度的重组黄色荧光蛋白与吸光度值之间的线性关系。

1.6 球虫可溶性蛋白中黄色荧光蛋白含量测定 以1.3和1.4确定的包被抗体与检测抗体浓度，加入已知总浓度的基因重组球虫可溶性蛋白，同时设置不同浓度原核表达的黄色荧光蛋白绘制标准曲线，以野生型球虫可溶性蛋白作为对照，按照1.3反应条件进行检测。以不同浓度原核表达的黄色荧光蛋白及其对应的OD450值绘制标准曲线，并得到吸光度值与蛋白浓度的线性方程。根据基因重组球虫蛋白孔的吸光度值和线性方程推算球虫可溶性蛋白中黄色荧光蛋白的浓度，进而确定其表达水平。

1.7 数据处理与分析 所有数据均使用Microsoft Excel(2016)软件进行处理与分析，部分图片采用GraphPad Prism 7.0软件生成。

2 结果

2.1 夹心ELISA方法的建立 为了建立有效的检测混合组分中特定/单一蛋白含量的夹心ELISA方法，本文以黄色荧光蛋白为检测对象，对包被抗体的浓度、检测抗体的浓度进行了优化。结果显示，以2 μg/mL原核表达的黄色荧光蛋白为检测对象，商品化的兔源黄色荧光蛋白多克隆抗体作为包被抗体，吸光度值随着其稀释倍数的降低而升高，在1∶20 时达到饱和(图1)。同样，商品化的鼠源黄色荧光蛋白单克隆抗体作为检测抗体，吸光度值随着其稀释倍数的降低而升高，在1∶4 000时达到饱和(图2)。在此条件下(包被抗体1∶20稀释，检测抗体1∶4 000稀释)，不同浓度的黄色荧光蛋白与吸光度值之间呈现良好线性关系。因此，本文将包被抗体的浓度确定为1∶20稀释，将检测抗体的浓度确定为1∶4 000稀释。

2.2 基因重组球虫可溶性蛋白中黄色荧光蛋白含量的测定 基因重组球虫表达异源蛋白的水平受启动子的调控。对比组蛋白4(His4)和膜抗原13(SAG13)启动子调控黄色荧光蛋白表达的基因重组球虫EtM2e和EtER，前者的荧光蛋白强度弱于后者(见中插彩版图3)。利用建立的夹心ELISA方法对2株基因重组球虫荧光蛋白的表达水平进行测定。首先建立黄色荧光蛋白浓度和吸光度值的标准曲线，呈正相关线性关系(y=0.920 7x+0.096 3，R2=0.991 2)。以100.0 μg/mL的EtM2e和EtER可溶性抗原加入检测体系，吸光值分别为0.382和0.865，即黄色荧光蛋白的浓度分别为0.31 μg/mL和0.94 μg/mL。而加入野生型球虫可溶性蛋白的吸光度值为0.01，说明球虫组分与包被抗体和检测抗体无交叉反应。因此，黄色荧光蛋白在EtM2e和EtER可溶性蛋白的占比分别为3.1‰和9.4‰，证实SAG13启动子调控异源蛋白表达的水平优于His4启动子，与荧光显微镜观察一致。

图1 包被抗体最佳包被浓度的确定Fig.1 Determination of the optimal coating concentration of coated antibodies

图2 检测抗体最佳稀释浓度的确定Fig.2 Determination of the optimal dilution concentration of the detection antibody

3 讨论

本试验建立了测定球虫混合可溶性组分中黄色荧光蛋白含量的夹心ELISA方法，具有较高的灵敏性，实现了对不同启动子调控荧光蛋白表达水平的定量比较，为后续基因重组球虫作为疫苗载体启动子的选择等提供参考。

与常规蛋白定量方法，如双缩脲法、Lowry法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝结合法和BCA法等相比，本试验建立的夹心ELISA方法优势在于能够检测混合蛋白组分中特定/单一蛋白的含量或浓度[4]。影响夹心ELISA方法检测效果的因素很多，包括包被液、封闭液的选择，包被和抗原抗体反应时间等[5]，本试验仅对包被抗体和检测抗体的浓度进行了优化，其他反应条件则采取实验室前期建立的ELISA检测体系，检测灵敏度可达3.0 ng。在后续研究中，可对其他条件进行优化来提升检测的灵敏度。对本试验而言，影响检测效果的因素还包括包被抗体和检测抗体的特异性与反应性：(1) 球虫可溶性组分复杂，包含数千种蛋白，除与特定蛋白黄色荧光蛋白发生特异性反应外，与其他组分应无交叉反应(2.2结果已证实)；(2) 包被抗体、检测抗体与酶标二抗之间应无交叉免疫反应(2.1结果已证实)。

艾美耳球虫生活史复杂，宿主体内的裂殖生殖阶段异源抗原随着虫体的大量扩增而扩增，被宿主免疫系统识别，激发免疫应答，这也是球虫作为疫苗载体的优势之一[6-7]。基因重组球虫表达异源蛋白的水平在内生性发育的不同阶段表达水平可能存在差异，本试验基于孢子化卵囊阶段的基因重组球虫表达异源蛋白的水平，为分析内生性发育各阶段异源抗原的表达水平提供了科学依据。挖掘高效的持家基因启动子是提升基因重组球虫表达异源蛋白水平的有效策略，也是优化其作为疫苗载体的突破口之一。

4 结论

本试验建立了一种测定混合组分中特定/单一蛋白含量的夹心ELISA方法，具有较高的灵敏性。