槲皮素通过PINK1/parkin通路激活线粒体自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤*

魏思灿，林天来，黄 玲，苏志伟，魏梅娟

（福建医科大学附属泉州第一医院重症医学科，福建泉州 362000）

缺血性脑卒中是脑卒中死亡的首要原因，具有高致死率和高致残率等特点［1-2］。使缺血的脑组织恢复血液供应，是急性脑梗死的主要治疗目的，然而快速恢复缺血脑组织血液供应过程中，会对脑组织造成一定损伤，故临床称之为脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤［3-4］。I/R 的病理生理过程极为复杂，但近年来研究发现线粒体自噬在I/R 和脑卒中过程发挥重要作用［5-6］。PTEN 诱导激酶1（PTEN-in⁃duced putative kinase 1，PINK1）和帕金蛋白（parkin）协同作用可启动线粒体自噬，特异性清除受损线粒体，保护组织免受损伤［7-8］。因此研究I/R过程中线粒体自噬相关蛋白PINK1/parkin 的表达及调控，对缺血性脑卒中的研究具有重要意义。槲皮素（querce⁃tin，QUE）是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗病毒等多种生理活性，且对心、肝、皮、肺、肾及神经系统等多种组织有保护作用，近年来研究发现槲皮素能减轻心、肾及脑等组织缺血再灌注损伤［9-10］，但对组织缺血损伤过程中线粒体自噬通路的调控作用尚未见报导。本研究建立大鼠I/R 脑损伤模型，在此基础上探讨槲皮素治疗I/R 可能存在的新药理机制，为临床合理用药提供参考。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级同遗传背景SD 大鼠，体重200～220 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK（粤）2018-0002，动物质量合格证号为SY2019071906。所有大鼠于本院动物房中饲养，饲养条件：自然光照，自由饮食、饮水，温度25℃，相对湿度50%，噪音低于80 分贝，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。本实验经本院伦理委员会批准，符合3R原则。

1.2 主要试剂及仪器 槲皮素购自上海源叶生物科技有限公司，规格为20 mg，纯度≥98%；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）购自Sig⁃ma；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司；丙二醛（malo⁃ndialdehyde，MDA）试剂盒购自上海沪震实业有限公司；白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA 试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒购自上海笃玛生物科技有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）购自上海研卉生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物科技公司；抗PINK1 和抗parkin、抗LC3-II 等抗体购自Abcam；BCA 蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶购自Pierce。RM2125RTS 型手动轮转式切片机和EM ACE900 型电子显微镜购自Leica；SMZ745 型光学显微镜购自Nikon；1659001 型蛋白电泳仪和Trans-Blot SD 型半干转膜仪购自Bio-Rad；GIS-500 型凝胶成像仪购自杭州米欧仪器有限公司等。

2 方法

2.1 大鼠I/R 模型的建立及分组给药 取SD 雄性大鼠60 只，将其分为假手术（sham）组、模型组（I/R组）、QUE 组（10 mg/kg）、3-MA 组和QUE+3-MA 组，每组12 只。槲皮素药物参照文献［11］用生理盐水稀释成1 g/L的溶液，3-MA参照文献［12］用磷酸缓冲溶液配制成100 moL/L 的溶液；槲皮素组按10 mg/kg 的剂量灌胃给予槲皮素；3-MA 组经腹腔注射给予3-MA 溶液2 μL；QUE+3-MA 组灌胃给予相应剂量的槲皮素，并经腹腔注射给予相应剂量的3-MA溶液；sham组和I/R 组均灌胃给予生理盐水，并经腹腔注射给予磷酸盐缓冲液。各组大鼠均给药3 d，每次1 次。末次给药30 min 后，除sham 组外，其于各组大鼠均参照文献［10］构建大鼠I/R 脑损伤模型。具体操作方法为：3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，于枕骨下第一颈椎正中切水平切口，并暴露第一颈椎横突，通过翼小孔，将一直径为0.5 mm 的电凝针插入横突孔，将两侧椎动脉电凝，永久性阻断椎动脉血流，缝合切口。24 h 后再次麻醉大鼠，监测脑电图，脑电图恢复正常，暴露并游离双侧颈总动脉，用无创动脉夹夹闭15 min（此时脑血供全部被阻断造成全脑缺血，以脑电波变平为模型成功标志），然后开放动脉夹恢复血流灌注，缝合切口，待动物清醒后回笼饲养。Sham组暴露双侧椎动脉以及颈总动脉后予以缝合，待清醒后回笼饲养。各组大鼠在造模成功后，观察神经功能行为，麻醉处死，取材并进行后续实验。

2.2 神经功能缺损评分（neurological deficit score，NDS） 各组大鼠在造模成功后24 h，参照文献［13］，进行NDS 评分。NDS 评分包含大体表现、脑干功能、运动评估、感觉功能、运动行为、行为学及惊厥情况七项功能，满分80分，0分判定为脑死亡。

2.3 脑梗死体积的检测 做完神经功能缺损评分后，随机取6只大鼠，麻醉后立即取脑，迅速置于−20℃中冰冻。待组织冻硬后，在冰上将大脑由前向后做冠状切片。放入质量分数为2%的TTC 染液中，37℃避光染色20 min，隔10 min 翻动一次。红色为正常组织，白色为梗死灶。染色完成后，于质量分数为4%的多聚甲醛中固定，4℃过夜后拍照。用ImageJ 1.41软件统计每个脑片梗死面积及正常组织面积，并计算梗死体积百分比：V（%）=（Al+A2+…+An）/（BI+B2+…+Bn）（A 为每个脑片梗死区域面积，B为每个脑片梗死侧大脑半球面积，n为脑片序号）。

2.4 大鼠海马组织的透射电镜观察 每组随机取6只大鼠，用3%戊巴比妥钠麻醉，心脏灌注（穿刺灌注20 min，生理盐水灌注50～100 mL，4%多聚甲醛灌注150 mL）后迅速断头、取脑，剪取0.5 g 海马组织，置于−80℃冰箱保存备用，其余组织迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24 h于冰上用双面刀片切取海马组织，切成5 μm 的切片，置于盛有预冷的体积分数4%的戊二醛中，用电镜观察线粒体形态。

2.5 大鼠海马组织IL-6、TNF-α、SOD 活性和MDA含量检测 取2.4 中−80℃保存的海马组织，于4℃条件下解冻后，通过匀浆器以1∶9 的比例均化样品和生理盐水制备脑匀浆（10%），3 000 r/min 冷冻离心4 min，获得上清液，按ELISA 试剂盒说明书检测IL-6 和TNF-α 含量。按SOD 和MDA 试剂盒说明书分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸缩合法检测海马组织SOD 活性和MDA 含量。剩余脑组织匀浆液迅速置于−20℃冰箱中保存。

2.6 Western blot 检测海马组织PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白的相对表达水平 取2.5 中剩余组织匀浆液，于4℃冰箱中解冻后，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，蛋白定量BCA 试剂盒检测蛋白总浓度后，取50 μg 蛋白上样，进行电泳和转膜反应，TBST 溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，TBST 溶液清洗3 次后，加入Ⅰ抗［PINK1、parkin 和LC3-II 抗体1∶1 000 稀释，β-actin（内参照）抗体1∶2 000 稀释］，4℃摇床中孵育过夜，加TBST 振洗后加入HRP 标记羊抗鼠II 抗（稀释倍数1∶2 000），37℃摇床中孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增强化学发光法显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并以ImageJ 软件分析各组蛋白相对表达量。

3 统计学处理

以SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较进行单因素方差分析，进一步两组间比较行SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠NDS评分结果

与sham组相比，I/R组、QUE+3-MA组、QUE组及3-MA组大鼠NDS评分降低（P＜0.05），脑梗死体积增大（P＜0.05）；与I/R 组和QUE+3-MA 组相比，QUE 组NDS 评分升高（P＜0.05），脑梗死体积减小（P＜0.05），3-MA组NDS评分降低（P＜0.05），脑梗死体积增大（P＜0.05）；I/R 组与QUE+3-MA 组相比，上述指标的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表1。

2 各组大鼠脑梗死体积检测结果

TTC 染色显示，sham 组大鼠的大脑组织呈均匀淡红色，无脑梗死病灶；与sham组相比，I/R组、QUE+3-MA 组、QUE 组及3-MA 组脑梗死部位被染成白色，且梗死体积增大（P＜0.05）；与I/R组及QUE+3-MA组相比，QUE 组脑梗死体积缩小（P＜0.05），而3-MA 组脑梗死体积增大（P＜0.05）；I/R 组与QUE+3-MA 组相比，上述指标的差异无统计学显著性（P＞0.05），见图1、表1。

3 各组大鼠海马组织线粒体结构检测结果

Sham 组大鼠海马组织线粒体形态正常；I/R 组及QUE+3-MA 组海马组织线粒体肿胀、内部嵴破坏或消失严重，并有自噬溶酶体形成；与I/R组及QUE+3-MA组相比，QUE组海马组织线粒体肿胀及内部嵴破坏明显减轻，形态较为正常，自噬溶酶体形成较多；而3-MA 组海马线粒体结构有空泡样变性，且破坏明显，见图2。

Figure 1.TTC-stained cerebral infarction map of rats in each group.图1 各组大鼠TTC染色脑梗死图

表1 各组大鼠NDS评分和脑梗死体积的比较Table 1.Comparison of NDS and cerebral infarction volume of rats in each group（Mean±SD）

Figure 2.Ultrastructure of mitochondria in hippocampus tissues of various groups.The black arrows indicate mitochondria，and the red arrows indicate autophagolysosome.The scale bar=500 nm.图2 各组大鼠海马组织线粒体超微结构图

4 各组大鼠海马组织氧化应激相关蛋白及炎症因子表达的结果

与sham组相比，I/R组、QUE+3-MA组、QUE组及3-MA 组大鼠海马组织的IL-6、TNF-α 和MDA 含量升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）；与I/R 组和QUE+3-MA 组相比，QUE 组的IL-6、TNF-α 和MDA 含量降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05）；而3-MA组大鼠海马组织的IL-6、TNF-α和MDA含量升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05）；I/R 组与QUE+3-MA组相比，上述指标的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表2。

5 各组大鼠海马组织PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白的表达结果

与sham 组相比，I/R 组、QUE+3-MA 组、QUE 组及3-MA 组大鼠海马组织的PINK1、parkin 和LC3-II蛋白表达升高（P＜0.05）；与I/R组和QUE+3-MA组相比，QUE 组海马组织的PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白表达升高（P＜0.05），而3-MA 组的PINK1、parkin、LC3-II 蛋白表达降低（P＜0.05）；I/R 组与QUE+3-MA组相比，上述指标的差异无统计学显著性（P＞0.05）。见图3、表3。

表2 各组大鼠海马组织IL-6、TNF-α和MDA含量及SOD活性比较Table 2.Comparison of IL-6，TNF-α，MDA and SOD levels in hippocampus tissues of various groups（Mean±SD. n=6）

Figure 3.Western blot for protein expression of PINK1，parkin and LC3-II in hippocampus tissue of rats.图3 各组大鼠海马组织PINK1、parkin和LC3-II的蛋白表达

表3 各组大鼠海马组织PINK1、parkin和LC3-II蛋白表达比较Table 3.The protein expression of PINK1，parkin and LC3-II in the hippocampus of rats（Mean±SD. n=6）

讨 论

I/R 过程中氧化应激及炎症反应，会引起脑组织损伤，造成患者瘫痪、视听觉消失及痴呆等行为，而运动、感觉及认知等神经功能异常行为，可间接反映大鼠脑损伤程度［14］。本研究发现，与sham组相比，I/R模型组大鼠NSD 评分明显降低，脑梗死体积增大，海马组织中氧化应激指标SOD 活性降低，MDA 含量升高，炎症指标IL-6 和TNF-α 含量均升高，提示I/R 组大鼠脑组织可能发生炎症及氧化应激反应，大鼠出现神经功能受损及脑组织损伤，表明造模成功。

槲皮素具有抗炎和抗氧化作用，近年发现其可抵抗I/R 脑损伤，且受到研究者的关注。黄超等［15］发现槲皮素可通过降低氧化应激反应、拮抗炎症反应、抑制神经细胞细胞凋亡等途径治疗创伤性脑损伤。杨青丽等［16］发现槲皮素对缺氧缺血性脑损伤神经元细胞有保护作用。本研究发现，与I/R 模型组相比，槲皮素组大鼠NSD 评分升高，全脑梗死体积、IL-6、TNF-α及MDA含量降低，SOD活性升高，表明槲皮素可抑制I/R 模型大鼠氧化应激反应及炎症损伤，减轻脑组织损伤，与上述文献研究一致。

线粒体功能紊乱，也是脑I/R 中脑组织及细胞损伤的关键因素之一［5］。但线粒体自噬在I/R 过程中的作用也一直存在争议，李翔等［17］发现诱导自噬可抑制脑I/R 中神经细胞损伤和组织损伤，左玮等［18］发现通过激活线粒体自噬，可改善I/R。而Shi 等［19］及Zhou 等［20］发现抑制线粒体自噬，可达到抑制自噬性细胞死亡的目的。本研究发现，与Sham 组相比，I/R模型组大鼠脑组织出现线粒体肿胀、内部嵴破坏或消失、结构空泡样等严重病理变化，提示I/R 模型大鼠线粒体结构及功能损伤，自噬清除受损细胞功能受到抑制。有文献研究发现，槲皮素可激活线粒体自噬，缓解组织损伤。马玉珍等［21］发现槲皮素可促进骨骼肌线粒体自噬蛋白的表达，抑制炎症反应，发挥保护效应；黄超等［15］发现槲皮素可改善脑创伤性损伤组织中线粒体能量代谢，保护脑组织。然而，槲皮素对脑I/R 过程中线粒体功能的影响还未见报导。本研究结果显示，与I/R 模型组相比，槲皮素组大鼠海马组织线粒体病理变化明显减轻，表明槲皮素可减轻I/R 模型大鼠脑组织中线粒体损伤，保护线粒体功能。而槲皮素保护和改善I/R 脑组织线粒体功能的具体机制还不明确。

PINK1 是线粒体外膜蛋白，可作为线粒体受损的分子感受器，parkin 介导底物泛素化后，与LC3-II及ATP 酶增强子连接，产生线粒体自噬体［22］。叶亮等［12］发现抑制PINK1/parkin 通路蛋白表达，可使线粒体自噬水平降低，线粒体损伤及脑损伤加重。Wu等［23］发现激活PINK1/parkin 通路，可抑制脑神经细胞凋亡，发挥脑保护作用。本研究发现，与sham 组相比，I/R 模型组大鼠海马组织PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白表达均增高，表明I/R 模型大鼠机体脑组织中线粒体自噬水平升高。而槲皮素组大鼠海马组织PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白表达均明显高于I/R 模型组，推测槲皮素可进一步促进线粒体自噬，来抵抗I/R 大鼠脑组织氧化应激及炎性损伤，表明槲皮素可能是通过促进PINK1、parkin 蛋白表达，激活线粒体自噬来抵抗脑组织损伤的。为了验证这一推测，本研究设置PINK1/parkin 通路抑制剂3-MA 进行研究，发现与I/R 模型组及槲皮素组相比，3-MA 组大鼠PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白均显著降低，且NSD 评分降低，脑梗死体积增大，海马组织中SOD 活性降低，MDA、IL-6 和TNF-α 含量均升高，海马组织线粒体病理变化进一步加重，表明采用PINK1/parkin 抑制剂抑制线粒体自噬激活，可加重脑组织氧化应激及炎症损伤，从而加重脑组织损伤。而3-MA 与槲皮素联合应用后，大鼠上述指标与I/R 模型组相比无明显差异，表明3-MA 可逆转槲皮素激活I/R 模型大鼠脑组织线粒体自噬及改善脑损伤的作用，进一步证明槲皮素可能通过激活PINK1/parkin 通路，激活线粒体自噬，进而减轻脑I/R损伤。

综上所述，槲皮素可通过调控PINK1/parkin 通路蛋白表达，激活线粒体自噬，减轻脑I/R 损伤，为阐明和开发槲皮素治疗I/R 损伤提供一定参考。但脑I/R 过程中线粒体自噬体系相当复杂，而槲皮素调控线粒体自噬缓解脑I/R 损伤的其他分子生物学机制有待后续继续深入研究。