富组蛋白1在基础研究中的研究进展

邱越桦 王海燕

广州医科大学附属口腔医院 广州市口腔再生医学基础与应用研究重点实验室，广东广州 510182

富组蛋白（histatin）是一族富含组氨酸的抗菌肽，由人类腮腺和下颌下腺的腺泡细胞分泌，是口腔局部天然防御系统的重要组成部分[1-3]，现已分离出至少12种histatins，分别命名为histatin-1～12，其中histatin-1、-3、-5是最常见的天然组胺素，为组胺素总量的20%～30%[4]。在histatins家族中histatin-1和histatin-3为分别由基因HIS1和HIS2编码的全长产物，其余成员是histatin-1和histatin-3的蛋白水解产物[5]。此外，富组蛋白还可存在于泪腺中[6]。

富组蛋白1（histatin-1，Hst1）是这些抗菌肽中最重要的蛋白之一，具有38个氨基酸残基，使用β受体阻滞剂可减少其分泌[3]，具有促进细胞黏附、伸展、迁移、血管化生、抗炎等多方面作用[5-7]，参与构成宿主免疫防御系统的第一道防线，同时也与多种肿瘤性疾病密切相关。此外，富组蛋白1可负载于多种生物材料上, 具有良好的生物相容性和生物安全性[8]。近年来研究表明，Hst1具有难以估计的医用价值和产业化前景，因此，了解Hst1的生物学功能和作用机制与其在临床中应用的相关进展是很有必要的。

1 Hst1的生物学功能及其作用机制

1.1 抗菌及抗真菌

以往研究表明[9]，Hst1在人的唾液中有高水平表达，可参与构成天然免疫防御系统，对革兰阳性、阴性细菌、真菌均能产生较强杀伤或抑制作用。其能在细胞膜上形成孔洞，使膜内物质流出导致细胞死亡；也能作用于细胞内的蛋白质和核酸来杀死细胞，但对宿主细胞的毒性极低[10]。此外，Mireille等[8]发现，Hst1可以刺激宿主细胞分泌CCL20，CCL20对许多病原体，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌等具有直接抗菌活性，对控制创伤后细菌感染起重要作用[11-13]。由于Hst1具有参与获得性膜形成及抑制羟基磷灰石沉积的作用[14]，再综合其抗菌的特性大致可以推测，在口腔内，Hst1对以细菌为主要致病因素的疾病，如龋病、口腔黏膜病和牙周病等的发生发展均有重要的预防作用。

1.2 促进创伤愈合

Menno等[5]研究发现唾液中Hsts低表达的人群口腔黏膜创伤后的愈合延迟，且唾液中的Hst1能显著促进口腔黏膜上皮细胞在体外划痕试验中的创伤愈合，由此推测Hst1在口腔黏膜创伤愈合过程中起重要作用,该过程的主要作用机制可能是Hst1与G蛋白偶联受体作用后内吞产生效应。

蒋艳[9]使用体外细胞划痕法对人表皮细胞标准株（HaCaT）造成机械性损伤后向其中加入Hst1发现，3～100 μg/ml Hst1均能够活化HaCaT细胞并促进其增殖与迁移。使用相似方法对人成纤维细胞株（HF）进行试验，结果表明，Hst1具有促人成纤维细胞增殖作用，但促迁移作用较弱，具体作用机制尚不清楚，推测是Hst1的受体可能在其他部位的组织细胞上也有表达。表皮细胞与成纤维细胞都是参与创伤修复的重要细胞，Hst1对其作用为其用于皮肤创伤治疗提供了可能性依据。

1.3 促进细胞黏附

近年来研究发现，在伤口愈合过程中起主要作用的是人类唾液中的富组蛋白，这是因为它们能促进细胞的黏附迁移[5]。有学者发现，Hst1在非活性的玻璃表面或钛表面均可以显著的促进上皮细胞的黏附和迁移[14-15]。体外实验证实，Hst1多肽可促进间充质干细胞黏附[16]、伸展、血管化生、迁移，且能诱导Zo-1基因表达[17]，使Zo-1和E-cad水平升高，Zo-1具有对胞间接触与紧密连接再定位的功能，E-cad积聚可促进胞间黏附[18]。Torres等[19]指出，Hst1是通过促进口腔角质形成细胞、牙龈和真皮成纤维细胞、非口腔上皮细胞和内皮细胞的细胞黏附和迁移来促进再上皮化和血管生成反应的。

1.4 对抗癌细胞

miR-21是人类恶性肿瘤中广泛存在的异常miRNA之一，其在不同类型的恶性肿瘤中明显上调，其过表达程度与癌症患者的预后有相关关系，表达水平越高，患者的预后相对越差。实验发现，Hst1可以和miR-21结合对下游STAT3信号通路因子产生激活作用，进而干扰肿瘤细胞的迁移[20]。

2 Hst1相关的临床试验

2.1 对紫外线致人角膜上皮细胞光损伤的保护作用

紫外线可以诱导角膜发生光损伤，使细胞膜中的脂质过氧化，还可以直接损伤DNA，降低线粒体功能，导致人角膜上皮细胞发生凋亡现象。实验证明[21]，人角膜上皮细胞（HCECS）凋亡水平与紫外线照射时间和强度呈现显著正相关性。Huang等[22]在紫外线照射后检测HCECS的增殖活性，发现经过Hst1预处理的HCECS增殖活性比未处理的HCECS更高；相比之下，照射后Hst1处理细胞中Bax表达显著下调，说明HST1可抑制辐射诱导的HCEC凋亡。这些结果提示，Hst1可能具有预防紫外线损伤的临床意义。

2.2 制备促进大面积皮肤缺损修复的复合材料

动物实验证实，Hst1多肽皮下注射后可加速大鼠皮肤缺损的愈合速度，且Hst1多肽及复合组Hst1的水凝胶、膜、膏、及海绵等材料可促进大鼠皮肤缺损的愈合[7]，由此可知道Hst1多肽具有促进非口腔黏膜愈合的作用。由于Hst1多肽具有良好的生物相容性和生物安全性，无免疫排斥和成瘤性等副作用，制备技术简单，价格便宜，因此应用Hst1多肽制备促进大面积皮肤缺损的修复材料具有良好产业化前景。

2.3 促进牙种植体整合

细胞黏附是牙种植体成功整合的关键，快速的软组织整合对种植体周围形成密封环境和防止感染非常重要。有研究得出[16]，Hst1增强了口腔上皮细胞和成纤维细胞对羟基磷灰石的附着和扩散，有利于防止种植体周围感染而导致的种植体失败和骨丢失；还可通过增加上皮细胞和内皮细胞的迁移促进再上皮化和血管生成，进而促进牙周组织的重建[15]。

2.4 作为眼表疾病治疗的靶点

研究表明[6]，Hst1存在于正常人的泪液中，且在正常人和缺水性泪腺发育不全（ADDE）患者之间存在含量差异。鉴于Hst1的上皮营养、伤口愈合、抗微生物和免疫调节作用，可假设其在ADDE的病理生理过程中发挥作用。由于此类研究不多，因此不作过多阐述。

2.5 预防和治疗颌骨骨坏死

唑来膦酸是与双膦酸相关的颌骨骨坏死最常见的致病因素，据报道，唑来膦酸对骨和血管细胞有细胞毒性，并且对血管内皮细胞的活性、迁移能力、黏附能力有影响[23]。因此，寻找新的方法来抵消细胞毒性作用将是开发颌骨骨坏死预防性治疗的首要条件。相关研究[24]通过体外小管形成实验的方法评估得到，Hst1可以抵消唑来膦酸对成骨细胞和内皮细胞的细胞毒性和抗氧化作用，并且恢复了两个细胞系的细胞活力和迁移能力。这些观察结果强调了在预防和治疗颌骨骨坏死的新疗法设计中Hst1的重要性。

2.6 构建新型组织工程化骨

大体积骨组织缺损的修复是医学中尚未攻克的重大难题之一[25]，这是由于临床应用的人工材料无法与人体组织融为一体;可吸收材料仅作为支架诱导骨生成,修复范围和修复效率有限[26]，且自体骨移植的临床应用存在较大的局限性。而组织工程化骨不仅为缺损部位的骨再生提供支架,本身也具有生成新骨的能力。

然而多数材料本身缺乏骨诱导性，无法实现完全的骨组织修复，因而不能单独用于大体积骨组织缺损的修复[27]，因此通过各种活性因子赋予医用材料高效骨诱导性是修复大体积骨缺损的关键。目前，表面改性是增强生物材料用于细胞黏附和增值性能的有效方式[28]。基于Hst1的众多特性可推断，Hst1能促进3D打印支架上干细胞的黏附、伸展、增殖、分化，并可尝试通过调配多肽与干细胞的比例使得细胞的增值率、存活率最大化。

3 Hst1结构对其功能的影响

3.1 磷酸化结构

Hst1在结构上还可以描述为一种富含组氨酸的磷酸化蛋白。Driscoll等[29]通过建立重组人Hst1的生产系统发现，缺乏磷酸丝氨酸的重组Hst1与羟基磷灰石的结合较唾液中的天然Hst1明显降低，而Hst1是通过吸附羟基磷灰石行使降低念珠菌活性和矿化的功能，由此表明，Hst1在残基2处的磷酸化结构与其杀念珠菌的作用有较强的相关性。

3.2 环化结构

Hst1的作用之一是诱导细胞扩散和迁移，是通过激活细胞上的G蛋白偶联受体进而激活ERK1/2通路而产生的。由于线性多肽的不稳定性，可以将环化作为稳定线性多肽的应对策略之一，这是因为环化结构能够降低蛋白折叠域与非折叠域的构象熵，使得天然环肽类物质具有较高的热稳定性和结构稳定性，同时具有抗水解、在化学变性剂条件下也能保持完整生物活性的特性。另外，Oudhoff等和Henks 等[30-31]先后采用逐步截断法，确定了活性所需的母肽最小结构域，并且发现，对Hst1的N-到C-末端进行环化可以增强大约1000倍摩尔活性，这表明作用的受体识别Hst1需要特定的构象，且环化结构可以使作用强度大幅度提升。

从以上两点可以知道，保留Hst1的磷酸化结构以及最小结构域，并且使用环化结构均能较好地发挥其杀菌和促进伤口愈合的作用，为以Hst1作为主要材料的新型皮肤伤口愈合剂的开发奠定了实验基础。这些特性在构建新型组织工程化骨方面也能发挥较大作用，如使用环状Hst1作为媒介材料可以在用量较少的情况下通过调配蛋白与干细胞的比例使细胞的增殖率和存活率最大化，这是由于环状结构的Hst1具有更高的活性。

4 总结

通过了解Hst1及其异构体的生物学功能和作用机制以及相关的临床应用，能够对其未来的发展方向有大致的了解。但各种临床应用相关的研究目前尚处于未成熟的阶段，如人眼角膜上皮损伤的临床应用，具体机制尚不清楚；构建新型组织工程化骨，目前尚处于实验阶段。这些都还需要在研究中不断剖析利弊，最后再将成熟的技术运用到医疗和产业化生产上。