碳酸酐酶Ⅰ与乳腺癌乳腺微钙化的相关性分析

李昌

（1 山东大学附属山东省千佛山医院医学研究中心，山东 济南；2滕州市中心人民医院病理科，山东 滕州）

0 引言

有文献报道，乳腺癌病变内微钙化的发生率高达30%-48%[1]。乳腺癌患者乳腺微钙化与预后较差显著相关[2]，但目前导致乳腺微钙化的机制尚不清楚。碳酸酐酶Ⅰ（Carbonic anhydrase Ⅰ，CA Ⅰ）属于碳酸酐酶（CA）家族成员，它能催化可逆性的CO2和H2CO3水合和脱水反应[3]。

选取CA Ⅰ基因上的SNP 位点rs725605，通过对乳腺癌患者及健康人进行TaqMan 基因分型。结果显示：在等位基因和基因型频率rs725605 上均与乳腺癌发生显著相关（P＜0.05），在遗传学上初步证实了CA Ⅰ是乳腺癌的易感基因。

我们检测了乳腺肿瘤组织和患者血液样本的CA Ⅰ的表达。

1 材料与方法

1.1 组织收集

所有组织样本和血液样本均来自山东大学附属山东省千佛山医院的患者（济南，中国）。肿瘤组织学的病理诊断，根据WHO 肿瘤病理分类系统进行。研究对象均签署知情同意书。山东省千佛山医院伦理委员会审核通过本项研究（参考编号2013012）。所有涉及人体受试者的研究（包括人体材料和人体数据）均符合《赫尔辛基宣言》的要求。

1.2 乳腺钼靶摄影

采用美国GE 公司生产的钼铑双靶全屏数字化乳腺摄影机，机型为GE-Senographe2000DS，摄影体位为双侧乳腺头尾位(CC)与内外侧斜(MLO)。由2名诊断经验丰富的高年资主治医师阅片，意见不一致时，通过讨论达成一致。

1.3 SNP 选择和Taqman 基因分型

应用TaqMan 技术对乳腺癌患者肿瘤组织进行基因分型分析。乳腺癌(n=285,女性,平均47.65岁)，健康对照(n=285,平均38.42岁)。所有收集血液样本均储存于含3.8%柠檬酸钠的抗凝管中。

使用Omega E-Z 96 Blood DNA kit(Omega,USA)试剂盒提取全血基因组DNA。使用ViiA 7 DX(Life Technology)进行基因型分析。反应在10ul 反应体系中进行：95℃变性10min，随后50个循环（循环为95℃变性15s，60℃退火和延伸1min）。每个样本的基因型通过Taqman 基因型软件V1.2(Life Technology)测量等位基因-特异性荧光获得。为确保基因型测定的精确性，每组设立重复样本和阴性对照样本。

1.4 免疫组织化学

Alenabio(中国)公司购得组织芯片切片，包含40例不同乳腺浸润性导管癌和8例不同正常乳腺组织。标准途径对组织芯片进行脱蜡和再水化，95℃柠檬酸盐缓冲液（Sigma）中抗原修复10min。内源性过氧化物酶抑制剂（MaixinBio,China）室温孵育30min。PBS 缓冲液冲洗，抗CA1 抗体4℃孵育过夜。TMS-P Kit(Maixin-Bio, China)免疫反应。

1.5 ELISA

采集乳腺癌患者(n=92, 女90名，男2名;22-78岁,平 均53岁) 和健康 志愿者(n=84, 女82名，男2名;23-77岁, 平均52岁) 的血液样本。4℃条件下3000g 离心10min，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液5 倍稀释，包被96-孔ELISA 酶标板，4℃孵育过夜。PBST 清洗，5%脱脂牛奶室温封闭1h，抗CA Ⅰ抗体1:1000 稀释加入96 孔板，室温孵育2h，PBST 清洗，加入稀释1000 倍的HRP 标记的抗山羊总IgG(Sigma)，室温孵育1h。PBST 洗板3次，TMB为底物显色。读取450nm 的吸光度值。

1.6 数据分析

应用SPSS25.0 软件分析数据。多重比较采用ANOVA分析。用t检验检测乳腺癌组织样本与对照组组织样本之间的显著性差异。P＜0.05 被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌患者钼靶摄影图像分析

乳腺浸润性癌多见分枝状、短棒杆状和细沙粒状钙化,成簇分布,导管内癌多沿导管线状钙化。钙化密度不均匀，直径大多超过3cm，微钙化灶数目多超过15 灶，伴有肿块、结构扭曲、毛刺征等恶性征象。乳腺纤维腺瘤见多发小点状及环状钙化。

2.2 肿瘤患者rs725605 位点基因分型

SNPrs725605 的等位基因频率(OR=0.722663,95% CI=0.570361-0.915634，P=0.007104)和基因频率(P=0.029009)都与乳腺癌显著相关。应用Plink v1.07 软件多元逻辑回归分析，发现等位基因频率和乳腺癌的相关性有统计学意义。

2.3 应用免疫组化技术观察CA Ⅰ在乳腺癌组织中表达

40例乳腺浸润性导管癌中有39例的CA Ⅰ显著表达(约占97.5%)。正常乳腺组织中CA Ⅰ没有明显表达。免疫信号主要位于乳腺癌的细胞质中。应用免疫组织化学法检测证实：CA Ⅰ广泛表达于乳腺癌组织中，但在正常组织中不表达。

2.4 乳腺癌患者血液中的CA Ⅰ水平

CA Ⅰ在乳腺癌患者( 平均OD 值=0.91±0.46) 血液中的表达水平对比健康对照组(平均OD 值=0.55±0.55)显著增加。其中14个乳腺癌血液样本(15.22%)与健康对照组的平均水平相比呈双倍或更高的表达水平。健康对照组中只有1个样本(1.19%)的CA Ⅰ水平较平均值增高。乳腺癌血液样本和健康对照组血清中CA Ⅰ水平明显不同(P=9.18×10-5)。酶联免疫吸附实验发现：乳腺癌患者血液样本中CA Ⅰ的表达水平显著增加。

3 讨论

乳腺癌微钙化颗粒较细,数目较多,密度较低,分布相对较广[4,5]。不伴肿块的钙化，临床病理证实多为原位癌或导管内癌。长管状、线杆状及分枝状钙化多为粉刺癌。散点状、泥沙样钙化，钙化直径＜0.5mm，形态不规则，大小不等多为筛状和微小乳头状导管原位癌。乳腺良性病变微钙化颗粒较粗大、数目较少、密度较高、形态规则。研究发现：rs725605 位点突变与乳腺癌发生密切相关，CA Ⅰ基因表达升高与乳腺癌发生密切相关，升高的CA Ⅰ在乳腺癌肿瘤微钙化中发挥重要作用[6-12]。

笔者认为，CA Ⅰ在乳腺癌微钙化中通过以下途径发挥作用：乳腺癌细胞生长过程中受到缺血缺氧、低血糖、免疫攻击等因素影响，癌细胞周围微环境改变，触发线粒体凋亡途径、β 粒酶介导细胞凋亡途径等，导致癌细胞凋亡。癌细胞内大量磷酸根和Ca2+进入周围微环境，形成钙盐沉积微环境，促进乳腺微钙化形成。

因此CA Ⅰ在乳腺癌患者中高表达，并在乳腺癌患者乳腺微钙化中发挥重要作用。