乳腺癌病人外周血中循环肿瘤细胞的检测及意义 *

吉 茹, 吴 敏, 赵戈昱, 郭志娟

(1.内蒙古医科大学附属人民医院病理科,内蒙古呼和浩特010020; 2.内蒙古医科大学研究生学院)

乳腺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高,现已超过宫颈癌而跃居女性恶性肿瘤的第一位。尽管采取手术及放、化疗等一系列治疗方法取得了很好的疗效,但复发和转移仍是影响病人生存率和导致病人死亡的最主要因素。对于乳腺癌转移过程的认识,“种子-土壤”学说仍是主流观点,即肿瘤细胞自原发灶脱落,直接或经淋巴系统间接进入血循环系统形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC),进而在远处组织、器官增殖,最终形成转移灶[1]。因此早期发现血液中的CTC,对于病人预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。而且,CTC的检测作为液体活检的一种重要方法,具有创伤小、可连续多次检测等特点[2]。本研究检测乳腺癌病人外周血中CTC情况,探讨其与临床病理特征的关系及对于乳腺癌病人的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016-01～2018-12于本院乳腺外科进行手术治疗的女性乳腺癌病人125例,病人年龄26～69岁,平均年龄44.7岁,其中102例为浸润性导管癌,13例为浸润性小叶癌,其他组织类型10例。收集同期乳腺良性肿瘤病人30例(其中乳腺纤维腺瘤22例,导管内乳头状瘤8例),年龄27～65岁,平均年龄43.5岁。纳入标准:(1)所有病人均经手术病理确诊;(2)就诊前未接受任何相关辅助性治疗;(3)无其他部位恶性肿瘤病史;排除标准:(1)炎性乳腺癌或机体处于急性炎症过程中;(2)哺乳期乳腺癌。两组受检者一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1CTC富集方法 采用阴性富集联合免疫荧光原位杂交法。将每例受检者的外周血3.2mL采集至ACD 抗凝管中,应用莱尔生物医药公司的阴性富集方法捕获CTC。(1)去除血浆蛋白:用CS1溶液处理血样,650g离心5min,去上清至12mL;(2)去除红细胞:用CS2溶液裂解红细胞,补足液体至45mL,将离心管置于垂直混匀仪混匀,室温放置10min,650g 离心5min,去上清至1.5mL;(3)去除白细胞:每管加入150μL 免疫磁珠(偶联有抗人白细胞表面抗原单克隆抗体组合群),固定于摇床上,摇动15min;(4)涂片:离心弃上清液后余100μL细胞悬液,涂于正电荷处理的玻片上,滴加固定液固定；(5)imFISH:标本脱水后,加入CEP8/CEP17混合探针10μL,盖上盖玻片,放入杂交仪,75℃变性5min,37℃杂交1.5h,加CD45抗体行免疫荧光染色1h,滴加DAPI,封片。

1.2.2结果判读方法 CEP8/CEP17均以信号点≥3为阳性。满足CEP8/CEP17+,同时CD45-及DAPI +的细胞视为阳性细胞。阈值为2,即当阳性的CTC计数≥2时,该标本即可计为阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS22.0软件进行统计分析,实验结果组间比较用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌病人与乳腺良性肿瘤病人CTC检测情况分析

125例乳腺癌病人中CTC阳性96例(76.8%),乳腺良性肿瘤病人中CTC阳性1例(3.33%),两组比较差异有统计学意义(χ2=55.763,P=0.000)

2.2 乳腺癌病人血中CTC检测与临床病理特征的关系

CTC 检测阳性与乳腺癌病人的年龄、肿瘤大小、肿瘤组织类型及组织学分级均无关(P>0.05),而与脉管侵犯及淋巴结有无转移有关(P<0.05)(见表1)。

2.3 不同分子类型及免疫组织化学指标病人CTC表达情况

CTC 检测阳性与乳腺癌分子分型及免疫组织化学指标ER、PR、HER2、ki-67的表达情况均无关(P>0.05)。

3 讨论

循环血中肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落入血液循环的肿瘤细胞,是连接原发肿瘤和转移性疾病形成的重要概念。CTC能够真实反映肿瘤负荷、具有发展为转移病变的潜力。在转移性疾病的条件下,对于经历了转移进展及随着疾病进程参与了疾病耐药和进展的细胞来说,CTC有望为其生物学特征和行为提供重要的洞见[3]。有研究发现,肿瘤干细胞(CSC)的表型和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)状态的获得之间是有相似性的。上皮-间质转化(EMT)是指上皮细胞在形态学上发生的变化,晶体状的上皮细胞向梭形的间质细胞表型转变,并获得了移行能力,从而具有较强的转移潜能,在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用[4]。肿瘤细胞在原发部位通过EMT的作用,侵入周围血管。进入血液循环的肿瘤细胞,在血流的剪切力和凋亡的作用下,只有极少数能存活下来,有研究结果验证出CTC是肿瘤干细胞中恶性程度最高的一个亚群,这些肿瘤细胞具有高度活性及高度的侵袭转移潜能[5,6]。

表1 乳腺癌病人血中CTC阳性情况与临床病理特征的关系

在乳腺癌中,CTC的计数已经被证实对于进展和生存来说都是重要的预后因子。有研究发现,大约30%的早期乳腺癌会出现肿瘤细胞脱落入血形成CTC,说明CTC是恶性肿瘤侵袭转移的一个早期事件,在肿瘤形成的早期即已存在[7]。本实验在乳腺良性肿瘤与乳腺癌病人中检测CTC,两组间差异有统计学意义。乳腺癌病人中CTC的检出情况与病人的年龄、肿瘤大小、组织类型、组织学分级以及分子分型等均无关。本实验结果中乳腺癌病人外周血中CTC阳性与有无淋巴结转移及有无脉管瘤栓密切相关。肿瘤细胞能分泌血管内皮生长因子,促进肿瘤血管的形成从而促进肿瘤的生长。进入血循环的CTC可在血管中形成癌栓,这些CTC在一定条件下又可以通过间质-上皮转化(MET),经血液循环播散到全身重要脏器及淋巴结形成转移灶[8]。国外的大样本、多中心临床研究发现,外周血中检出CTC可以预测乳腺癌的早期复发转移,从而为临床适当的治疗提供依据,提高病人的生存率及生存时间,且化疗后的病人CTC的存在可以作为总生存期和无进展生存期的独立预测指标,CTC数量越多,危险度越高,生存期越短[9]。

乳腺癌的诊疗方法一直在不断的提高,但是乳腺癌病人的病死率仍较高,多数是因为发生了复发及远处转移所致。肿瘤细胞在疾病进展的各个时期均可以从原发灶及转移灶进入外周血循环,依靠影像学技术不能早期检测到极微小的病灶,从而延误了最佳的治疗时机。然而,CTC检测技术的发展,为病人带来一种无创且敏感的方法,可以及时监测肿瘤的进展,便于临床医师调整治疗方案,提高病人的远期生存率及生存质量。