胶原诱导性类风湿关节炎大鼠模型制备及早期表现评价 *

苏云龙, 王雪梅

(1.内蒙古鄂尔多斯市中心医院CT-MRI室,内蒙古 鄂尔多斯市 017000, 2.内蒙古医科大学附属医院)

类风湿关节炎(RA)是一种免疫炎症性疾病,常常导致关节疼痛和僵硬,关节结构性损伤及功能性残疾[1,2]。如果不在早期进行及时有效的治疗,病情一般发展迅速,大约有90%的病人在2a后可导致关节畸形或残疾,从而使生活质量和工作能力严重下降[3，4]。

动物模型在类风湿关节炎治疗药物筛选和发病机理研究等方面有非常重要的作用。目前,类风湿关节炎动物模型的制备方法有很多种,但是大多数模型建立的周期都比较长、成功率也比较低,严重影响RA的进一步深入研究。Ⅱ型胶原免疫诱导类风湿关节炎模型的临床表现、病理改变与人类RA比较相似,是被公认的最佳类风湿关节炎动物模型[5]。本文通过Ⅱ型胶原乳剂免疫诱导的方法制备大鼠 CIA 模型,并对其进行病理学及影像学方法进一步评价,试图找出类风湿关节炎大鼠模型早期研究的最佳时期。

1 材料及方法

1.1 材料

健康雌性Wistar 大鼠(清洁级),60只,体重185～205g,周龄8～9wk。饲养1wk后分成2组,CIA组50只;空白对照组10只。牛Ⅱ型胶原(产地美国Sigma公司),足爪体积测量仪(自制,专利号:ZL201420335087.3),X线机(GE公司)。

1.2 方法

1.2.1模型建立 CIA组大鼠用型胶原乳剂分别行初次免疫与加强免疫两次给药的方法建立模型。将大鼠用水合氯醛麻醉后,分别在尾根部和背部脊柱两侧多点皮内注射乳剂。初次免疫分别在CIA组大鼠的尾根部和背部(0.2～0.4mL/只)皮内注射型胶原乳剂,初次免疫2wk后,同样将型胶原乳剂分别在尾根部和背部皮内注射(剂量为0.3mL/只)进行加强免疫。空白对照组大鼠将同等剂量的生理盐水分别在尾根部及背部皮内注射做为阴性对照。

1.2.2观察测量内容及评分

1.2.2.1观察大鼠的临床表现

造模前及造模后每5d测一次实验大鼠体重,并记录临床特点变化情况,其中包括大鼠的饮食量、体毛的颜色改变、关节肿胀程度及活动度。

1.2.2.2计算关节肿胀度

采用排水法用自制的足爪体积测量仪测量大鼠足爪体积,并分别计算出各足爪的肿胀度。从造模后(注射药物开始免疫后)0～45d每隔5d用足爪体积测量仪检测一次足爪的体积,每个足爪每次要测定三次,最后算出平均值。关节肿胀度计算公式为:关节肿胀度=(测量值-造模前所测值)/造模前所测值×100%。

1.2.2.3评分

造模后每5d观察并记录一次实验大鼠四肢关节部位的病变情况,然后行大鼠关节炎指数评分,根据每个关节的病变情况累计积分,即为每只大鼠的AI值(Arthritic Index,关节炎指数)。评分3分以上的大鼠为肉眼观察造模成功的模型。

评分标准:0分:无任何异常;1分:个别足趾关节有轻微肿胀;2分:大部分踝关节及足趾关节轻度肿胀,并有红斑;3分:踝关节及以下关节中度肿胀(肿胀度在40%～50%);4分:踝关节及以下关节重度肿胀(肿胀度在51%～75%);5分:踝关节及以下关节严重肿胀(肿胀度大于75%)。

1.3 χ线显像

造模前及造模后15d、25d、45d对实验大鼠进行踝关节放射X光检查,χ线机摄片设置参数条件为40KV。阅片由2位高级职称放射科医师分别进行,重点观察实验大鼠关节部位软组织肿胀情况,关节面是否有破坏,关节间隙有无狭窄等。

1.4 病理检测

实验大鼠造模后45d断颈处死,切取包括踝关节在内的整个足爪进行病理检测。最后由两位有高级职称的病理医师分别进行病理阅片,重点观察大鼠关节部位的病理变化,关节滑膜是否有炎细胞浸润,以及关节滑膜增厚情况,特别是血管翳形成及关节面下的骨、软骨破坏情况等。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 实验大鼠的一般状态

空白对照组大鼠随着饲养时间的增加,饮食良好,活动自如,毛发光泽,足爪未见明显肿胀。CIA组大鼠在造模后3～5d头部毛发开始发红,体温明显升高。造模后4～7d注射部位出现红肿和炎性小溃疡或结节,并逐渐加重,部分出现破溃。造模后8～12d毛发发红现象开始改善,破溃处逐渐有硬痂形成,而后结痂逐渐脱落。在造模5d后CIA组大鼠逐渐出现精神萎靡,饮食量明显减少,活动度减少,体毛无光泽干枯发黄,并有脱毛情况。

2.2 实验大鼠体重变化情况

空白对照组大鼠在饲养过程中体重是逐渐增加的。CIA组大鼠在造模后体重增长较正常大鼠明显缓慢,有部分大鼠体重有所下降。在造模25d后与同时间点空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),在造模40d后与同时间点空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

表1 造模后不同时间点各组大鼠体重(g)

2.3 实验大鼠踝关节局部的观察情况

空白对照组大鼠踝关节无肿胀,足爪局部是正常的粉红色,足爪体积也没有明显变化。CIA组大鼠在造模后第10d足爪局部可见有红斑,随后足爪红斑及肿胀程度逐渐加重,活动不便。到造模后第25d,CIA组大鼠共有78个足爪关节出现不同程度红肿及软组织肿胀,且大部分为后足,病变关节屈曲及活动受限,30d后红肿程度有所缓解,但持续轻-中度肿胀。

2.4 CIA组及空白对照组大鼠足爪体积的变化情况

空白对照组大鼠足爪体积在整个测量过程中增加稳定,各时间点前后差异没有统计学意义。CIA组大鼠在造模后15d足爪体积开始明显增加,与同时间点空白对照组大鼠足爪体积差异有统计学意义(P<0.01),CIA组大鼠在造模30d后足爪体积虽然稍有下降,但与同时间点空白对照组大鼠足爪体积差异仍有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表2 空白对照组与CIA组大鼠造模后的足爪体积表(ml)

2.5 CIA组及空白对照组大鼠关节炎评分结果

CIA组大鼠在造模后每5d进行一次四肢关节部位的关节炎指数评分,四肢评分值相加得总评分(0分～20分),评分在8～10分是比较严重的。在造模10d后随着免疫反应的发展,AI 值逐渐增加,并且各时间点 AI值均与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),其中30d时达峰值,之后稍有下降,在造模后25～45d中,评分3分以上的大鼠共有36只,其中,共有53个关节评分大于3分,而且大部分为后足关节,前足较少,成模率为72%(见表3)。

表3 空白对照组与CIA组大鼠造模后的评分表

2.6 关节的病理结果

空白对照组大鼠踝关节部位滑膜层未见炎细胞浸润,关节内无纤维增生,滑膜层未见增厚。CIA组大鼠踝关节滑膜层有炎细胞浸润,滑膜细胞数量可见明显增多,肥大的细胞排列不规则,滑膜细胞层数明显增厚,而且增生的滑膜可见有血管翳形成,并爬行到软骨面,开始侵蚀软骨及骨,部分有软骨及骨的侵蚀破坏。

3 讨论

类风湿关节炎是一种发病机制不明的自身免疫疾病[6],有研究发现遗传因素及生活环境与RA的患病风险密切相关。有效的实验动物模型是研究RA疾病早期发病机制的基础,建立合适的动物模型也为RA的诊断及治疗方法的研究提供了有力的保障,本文运用Ⅱ型胶原免疫诱导的方法成功建立了CIA模型,模型成功率是72%。

本文研究发现,CIA组大鼠在造模3d后陆续出现头部毛发发红、体温明显升高,进食量减少,活动减少,体重增长缓慢或下降等临床表现,这可能是体内的免疫应答反应导致的。CIA组大鼠在造模后15d足爪体积开始明显增加,在造模后25d体重及足爪体积与空白对照组差别均有统计学意义。在造模后25dCIA组大鼠踝关节软组织肿胀及红肿程度达到高峰,且大部分为后足。而且在整个实验过程中,CIA组大鼠足爪在造模25d时是肿涨高峰期,这与相关文献一致[7,8]。在造模后30d时CIA组大鼠AI值达峰值,之后稍有下降,但在造模后25～45d中评分均值都在5分以上,这可能是由于急性水肿期导致的。在造模后25d,CIA组大鼠X线片显示关节面光滑,关节间隙未见狭窄,而在45d后部分关节边缘可见有骨质破坏,说明在造模后45d时部分模型动物已经有关节功能的永久性损伤。

本实验研究结果证实,在造模后25d左右可能是胶原诱导性类风湿关节炎大鼠模型的发病早期,而在造模后45d部分动物模型已接近大鼠类风湿关节炎的中晚期,所以在造模45d后已经不适合对Ⅱ型胶原免疫诱导类风湿关节炎早期表现的研究。因此,本研究提示对早期胶原诱导性类风湿关节炎大鼠模型的研究应该在造模后25d左右进行,尤其是对类风湿关节炎早期发病机制及治疗的实验研究。