孟根乌苏-18味丸对银屑病样小鼠模型治疗的机制研究 *

白 爽, 图门乌力吉, 杨东生, 卫 玮, 吕新翔

(1.内蒙古医科大学附属医院皮肤科,内蒙古呼和浩特010050; 2.内蒙古医科大学附属医院蒙医科)

1 材料与方法

1.1实验动物

选取6～8wk雌性balb/c小鼠(购买于内蒙古医科大学动物中心)。饲养于恒温恒湿的SPF级别动物实验室,自由给水、取食。

1.2主要试验材料与仪器

孟根乌苏-18味丸购买于内蒙古呼和浩特市蒙医中医医院(生产批号:20160003),咪喹莫特乳膏(四川明欣利迪药业),HE染色液(上海碧云d生物技术有限公司)。切片机(上海徕卡仪器有限公司)、包埋机(湖北泰维科技实业有限公司)。酶标仪(BioTek,ELx800)、Mouse IL-17Precoated ELISA kit(DAKEWE Cat3∶1211702),生物显微镜(OLYMPUS CX41),组织匀浆机(上海净信实业发展有限公司,MY-20)。

1.3实验方案及分组

实验分为2组,分别为对照组及治疗组,每组15只小鼠。所有小鼠均于实验前1d麻醉后背部剃毛。将咪喹莫特乳膏外涂所有小鼠的背部(62.5mg/鼠),药时间为持续21d。第8～21d治疗组小鼠给予孟根乌苏-18味丸灌胃(0.66g/kg),实验组小鼠给以等量生理盐水灌胃。每d观察各组小鼠的背部皮损状况(包括红斑、鳞屑、皮肤厚度)。

1.4实验方法

1.4.1组织学检查 常规固定、脱水、包埋、切片、苏木精-伊红染色。

11月6日，证监会正式发布《关于完善上市公司股票停复牌制度的指导意见》（下称《指导意见》）。《指导意见》首次明确了上市公司股票停复牌的基本原则，最大限度保障交易机会。明确以不停牌为原则、停牌为例外，短期停牌为原则、长期停牌为例外，间断性停牌为原则、连续性停牌为例外。上市公司发生重大事项，应当按照及时披露的原则，分阶段披露有关事项的具体情况，不得以相关事项不确定为由随意申请股票停牌，不得以申请股票停牌代替相关各方的保密义务。

1.4.2表皮厚度及真皮内炎细胞浸润数的测量 采用PhotoshopCS4软件自带的套索工具进行表皮厚度的测量及真皮内炎细胞浸润数的测量

1.4.3小鼠脾指数及淋巴结横截面积计算 小鼠脾指数为小鼠脾脏重量与小鼠全身体重的比值。每只小鼠取4枚淋巴结,近似认为小鼠淋巴结为椭圆形,按照椭圆形面积公式计算小鼠淋巴结横截面积。

1.4.4皮肤组织匀浆的制备 将分装的皮肤组织置于d平上称重并记录。1×PBS快速漂洗后将皮肤组织置于1.5mL的EP管中,加入预冷的1×PBS。统一制成5%的组织匀浆。使用组织匀浆机在冰上研磨小鼠皮肤,离心(12000g,10min,4℃),吸取上清置于新的EP管中,并置于冰上用于ELISA检测。

1.4.5小鼠麻醉后采血,室温静置20min。采用离心法获取血清,(5000rcf,15min,24℃)分装血清并及时储存于-80℃冰箱。

1.4.6酶联免疫吸附实验(ELISA) 按试剂盒操作说明进行加样,加检测抗体,洗板,加酶,洗板,显色,终止反应,读板。用检测波长450nm读值。

2 结果

2.1组织学改变

两组小鼠组织学均表现为角化过度、角化不全,表皮增厚,表皮突延长,真皮内炎细胞的浸润。与对照组相比,治疗组小鼠表皮厚度明显降低(*P<0.05),炎细胞浸润数明显减少(**P<0.01)(如图1、2)。

2.2与对照组相比,治疗组小鼠脾脏明显缩小,脾指数及淋巴结横截面积明显下降(*P<0.05)(如图3、4)。

2.3皮损中IL-17的含量

与对照组相比,治疗组小鼠皮损中IL-17含量明显降低(*P<0.05)(如图5)。

2.4血清中IL-17的含量

我们没有检测到两组小鼠血清中IL-17的含量。

3 讨论

银屑病属于蒙医皮肤黄水(协日乌素)病,蒙医对于银屑病的治疗主要以调理三根,改善气血运行,燥协日乌素(黄水)为主要原则[2]。孟根乌苏-18味丸是经典的蒙药学方剂,由孟根乌苏(制)八钱、硫磺(制)四钱、文冠木膏剂等十八味药配制而成,该药载入1984年版《内蒙古蒙成药标准》[3]。孟根乌苏-18味丸主要具有燥黄水,消炎止痛,促进创口愈合,修复组织等功效。在皮肤病的治疗占到其临床应用的76.23%,主要包括:银屑病、痤疮等炎症性皮肤病[3,4]。本研究将蒙医药学与免疫学、皮肤病学相结合,探索性研究蒙药孟根乌苏-18味丸对银屑病的治疗效果及机制。

小鼠背部外涂咪喹莫特可以成功的诱导出与人类银屑病模型,这种模型在病理学、发病机制中均表现出与人类银屑病相一致的特点[5]。我们利用此模型为实验对象,结果显示,与对照组相比,治疗组小鼠表皮厚度及真皮内炎细胞浸润数均减少,这从组织病理学角度表明孟根乌苏-18味丸能够减轻银屑病样小鼠模型的症状,干预银屑病发病。

脾脏是免疫细胞定居的主要场所之一,同时也是机体进行免疫应答的重要部位[6],脾指数可以衡量药物对免疫器官的抑制作用[7]。我们的研究中,治疗组的脾指数、淋巴结大小与对照组相比明显下降,可见孟根乌苏-18味丸能够干预银屑病样小鼠模型的免疫应答,降低脾脏及淋巴结内异常增殖的免疫细胞的数量,进而抑制银屑病样小鼠模型的炎症通路及免疫反应。

Th17是一类新型的Th细胞群,分泌白细胞介素17(interleukin6,IL-17)等多种细胞因子。新近理论认为,Th17在银屑病发病过程中起着主导作用[9]。Th17相关炎症信号通路在银屑病的发病过程中起着重要的致病作用。在我们的实验中,治疗组小鼠皮损中IL-17的含量明显低于对照组,这表明孟根乌苏-18味丸通过下调皮损中IL-17的表达而起到对银屑病的治疗,进而我们认为孟根乌苏-18味丸通过干预Th17信号通路达到对银屑病的治疗作用。我们没有检测到两组小鼠血清中IL-17的含量,这可能是由于小鼠血清中IL-17含量少,低于检测下限而造成的。

综上,蒙药孟根乌苏-18味丸通过降低银屑病样小鼠模型表皮厚度、真皮内炎细胞浸润数及降低脾指数、淋巴结横截面面积及干预Th17相关炎症因子的表达对银屑病发挥治疗作用。