UPLC-MS/MS同时测定使君子药材中9个成分的含量△

温秀萍，彭琴，2，邹福贤，2，张广玲，于虹敏，许文，2*，林羽，2，徐伟，2*，余波

1.福建中医药大学 药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学 生物医药研发中心，福建 福州 350122

使君子是使君子科使君子属植物使君子QuisqualisindicaL.的干燥成熟果实，性甘温，归胃、脾经，用于杀虫消积、健脾胃、除虚热、杀脏虫[1]。现代药理研究表明，使君子具有抗菌[2]、抗病毒[3]、杀虫驱虫[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗高脂血症[7]、抗糖尿病[8]、抗癌[9]等多种药理作用。使君子化学成分研究表明，其主要含有有机酸类、鞣质类及挥发性化合物等[10-13]，这些成分是其多种药理作用的物质基础。

目前关于使君子质量控制的相关研究报道较少。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版中使君子以胡芦巴碱为含量测定的指标[1]；朱华等[14]以使君子中使君子酸钾含量为指标，比较广东、广西及四川省3个不同产地使君子的质量；陈芝华等[15]采用高效液相色谱法(HPLC)测定了不同产地使君子中葫芦巴碱的含量；李改仙等[16]测定了使君子叶和枝中的总黄酮含量；姜舜尧等[17]采用高效离子交换色谱法分析使君子药材中胡芦巴碱成分。但是鉴于使君子具有多方面的药理活性[2-9]，只检测单一成分存在一定的片面性，难以反映出药材的整体质量。查阅国内外文献，目前尚未见对使君子多成分测定的文献报道。因此，建立多成分综合评价的方法对使君子质量控制水平的提升有重要的意义。

随着现代分析技术方法的快速发展，超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)越来越多地应用于中药或复方的分析[18-21]，因质谱具有良好的专属性和灵敏度，有利于中药材和中药复方的多成分质量控制，常应用于中药复杂体系化学成分的定量或定性研究。

因此，本研究通过建立UPLC-MS/MS，同时测定使君子中9个化学成分(葫芦巴碱、香草酸、阿魏酸、丁香酸、儿茶素、鞣花酸、苹果酸、没食子酸和没食子酸甲酯)，并结合化学计量学筛选使君子的潜在质控标志物，为使君子质量控制提供参考。

1 材料

1.1 药材

使君子34批药材分别于2018年9月—2019年3月于广西(批号：GX1～GX8)、四川(批号：SC1～SC12)、广东(批号：GD1～GD4)、福建(批号：FJ1～FJ10)地区收集，经福建中医药大学药学院高级实验师范世明鉴定为使君子科植物使君子QuisqualisindicaL.的干燥果实，所有样品存放于福建中医药大学中药资源标本室。

1.2 试剂

对照品葫芦巴碱(批号：MUST-18050501)、阿魏酸(批号：MUST-19010106)、丁香酸(批号：MUST-18083107)、没食子酸(批号：MUST-18032401)、没食子酸甲酯(批号：MUST-19012503)、儿茶素(批号：MUST-18123009)、苹果酸(批号：MUST-19021503)、鞣花酸(批号：MUST-18112002)、香草酸(批号：MUST-18051106)均购于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于98%；甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；Milli-Q超纯水(美国Millipore公司)；其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色谱仪串联Xevo-TQS型三重四级杆质谱(美国Waters公司)；CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500DE型台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。

2 方法与结果

2.1 UPLC-MS/MS分析条件

2.1.1色谱条件 色谱柱为Welch Xtimate C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱(0～2.0 min，98%A；2.0～4.0 min，98%～60%A；4.0～6.0 min，60%～40%A；6.0～6.5 min，40%～98%A；6.5～8.0 min，98%A)；流速：0.20 mL·min-1；柱温：45 ℃；进样量：2 μL。

2.1.2质谱条件 正、负切换电喷雾离子源(ESI)，定性离子扫描模式(MS Scan)，质量数范围为m/z50～1000，子离子扫描模式(Daughter Scan)，定量采用质谱多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：负离子模式为-2.5 kV，正离子模式为3.5 kV；脱溶剂流速：氮气800 L·h-1；脱溶剂温度：500 ℃；锥孔气流速：氮气150 L·h-1；离子源温度：150 ℃；碰撞气体：氩气。其他质谱参数见表1。

表1 使君子中9个成分的质谱测定条件

2.2 溶液的配制

2.2.1对照品溶液制备 分别精密称取胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸、阿魏酸对照品适量，加入色谱甲醇制备成质量浓度分别为1.458、0.638、0.490、0.047、0.072、1.017、0.680、0.512、0.057 mg·mL-1的各单一对照品母液。精密量取适量单一对照品母液置于5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，得到9个对照品质量浓度分别为204.120、63.800、19.600、9.400、7.200、20.340、13.600、51.200、2.052 μg·mL-1的混合对照品储备液。取混合对照品储备液逐级稀释，即得不同质量浓度的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液制备 取使君子粉末(过二号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中。精密加入50%甲醇水溶液20 mL，密塞，称定质量。超声处理(功率：250 W，频率：50 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇水溶液补足减失的质量，摇匀，0.22 μm滤膜滤过。取续滤液按1∶19加入50%甲醇水溶液稀释，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1专属性考察 取供试品溶液、混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱和质谱条件进样分析，得到使君子正、负离子模式下的总离子流图，见图1。在MassLynx 4.1工作站中对正、负总离子流进行分子离子峰的识别，根据母离子、子离子质谱信息，结合使君子已有化学成分研究[10-13]，共鉴定9个成分，并经对照品比对，其tR、母离子、子离子质谱信息与对照品信息均一致。9个成分分离良好，空白无干扰，符合分析要求。

注：A.空白溶液；B.对照品溶液；C.使君子样品溶液(批号：FJ8)；1.胡芦巴碱；2.苹果酸；3.丁香酸；4.儿茶素；5.没食子酸甲酯；6.香草酸；7.丁香酸；8.鞣花酸；9.阿魏酸。图1 空白溶液、对照品溶液和使君子样品的MRM离子流色谱图

2.3.2线性关系及检测下限、定量下限考察 吸取2.2.1项下对照品溶液适量，用50%甲醇水溶液逐级稀释，配制系列质量浓度梯度的对照品混合溶液，按2.1项下条件进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，待测组分质量浓度为横坐标(X)进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程和相关系数(r)。以信噪比(S/N)为3计算9个待测组分的检测下限，以S/N为10计算9个待测组分定量下限，结果见表2。

表2 9个化合物回归方程、线性范围、r、检测下限及定量下限

2.3.3精密度试验 取同一份混合对照品溶液，在2.1项色谱、质谱条件下测定，记录峰面积并计算RSD。1 d内连续进样6次测定日内精密度RSD为1.2%～2.7%；每天进样3次，连续测定3 d，测定日间精密度RSD为1.3%～3.3%。实验结果表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性试验 按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、6、10、12、24 h按2.1项下色谱、质谱条件进样测定，根据标准曲线计算各个时间点9个组分质量浓度，计算RSD为1.3%～3.2%。实验结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5重复性试验 精密称取同一批次(批号：FJ8)使君子药材样品6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱、质谱条件进样测定，计算9个化合物质量分数的RSD为1.1%～2.4%，结果表明，实验方法重复性良好。

2.3.6加样回收率试验 精密称取2.3.4项下已测得含量的使君子粉末6份，约0.25 g，分别近似1∶1加入各对照品，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项下条件进样测定含量，计算回收率，9个成分的平均回收率为95.36%～99.47%，RSD为2.52%～3.44%，表明回收率良好。

2.4 样品含量测定

分别精密称取不同产地的使君子样品粉末，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱及质谱条件进样测定峰面积，将各组分峰面积代入回归方程计算得到样品中9个组分的含量结果，见表3。

表3 各批次使君子样品中9个成分的含量(n=3) mg·g-1

续表3

2.5 数据分析

将34批次使君子样品中9个成分的含量数据导入到OmicShare Tools热图聚类分析工具，设置归一化法，得到热图聚类分析图，见图2。纵向的聚类反映不同批次样品之间的关系，热图颜色的深浅反映不同批次样品中相应成分的含量。进一步运用GraphPad 8.01数据处理软件对4个产地使君子样品含量进行箱型图统计分析，见图3。采用SPSS 19对34批次使君子的含量进行主成分(基于最大方差法)的特征值贡献率分析，结果见表4～5。

注：1.胡芦巴碱；2.苹果酸；3.丁香酸；4.儿茶素；5.没食子酸甲酯；6.香草酸；7.丁香酸；8.鞣花酸；9.阿魏酸。图2 不同产地使君子样品中9个成分的热图聚类分析

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。图3 不同产地使君子中9个成分含量箱型图

表4 34批次使君子样品的主成分特征值贡献率

表5 使君子中9个成分对主成分的贡献值

3 讨论

3.1 色谱、质谱条件的选择

在色谱柱的选择上，比较了不同色谱柱：Waters HSS T3 C18(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)、Waters CORTECS C18(100 mm × 2.1 mm，1.6 μm)、Phenomenex kintecx(100 mm× 2.1 mm，1.7 μm)及Welch Xtimate C18(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)，结果表明，Welch Xtimate C18色谱柱在色谱峰的保留和峰形上优于其他色谱柱，并且达到基线分离的分析时间缩短，效率提高，因此选择该色谱柱。流动相系统的选择中，考察了4种流动相系统：乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液，实验结果证明，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液时，使君子样品中9个成分峰形优于其他系统，因此选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。质谱条件选择中，本实验采用MRM正、负离子切换模式同时定量9个待测成分，优选最佳的碰撞能量和锥孔电压，葫芦巴碱、香草酸、阿魏酸、丁香酸、鞣花酸在正离子模式下灵敏度高于负离子模式，而没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素及苹果酸则是在负离子模式下灵敏度较高。

3.2 样品含量测定结果分析

使君子药理研究表明其具有抗菌[2]、抗病毒[3]、杀虫驱虫[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗高脂血症[7]、抗糖尿病[8]、抗癌[9]等多种药理作用。从本次测定的指标来看，生物碱类成分葫芦巴碱是使君子的主要成分之一，其具有驱虫作用[12]；使君子中酚酸类成分没食子酸、鞣花酸、香草酸、苹果酸、儿茶素、丁香酸、阿魏酸、没食子酸甲酯等成分具有显著的抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、保肝[22-29]等作用，9个测定的成分可能均是使君子发挥药效的物质基础。对34批次不同产地使君子药材9个成分含量测定的结果表明，葫芦巴碱的质量分数最高，达到2.541～3.938 mg·g-1，其次是鞣花酸0.167～1.221 mg·g-1，其余成分含量较低，除苹果酸外，其他有机酸质量分数均低于0.5 mg·g-1。聚类分析结果表明，不同产地使君子表现为不同聚类方式。热图响应结果表明，胡芦巴碱、苹果酸、儿茶素在福建产使君子样品中的含量高于其他产区样品。从9个成分含量的箱型图可知，使君子指标性成分胡芦巴碱含量的中位值在福建和广西地区样品中高于四川和广东地区样品；福建产使君子样品中苹果酸、儿茶素含量的中位值高于其他3省；广东和福建产使君子样品中没食子酸和香草酸含量的中位值高于广西与四川样品；广东产使君子样品中鞣花酸含量的中位值显著高于福建、四川和广西样品；其他成分含量相对较低且不同产地之间差异不明显。主成分的累积贡献率结果表明，主成分1和2的贡献率最高，累积贡献率>50%，并且主成分1对应的最大贡献成分为胡芦巴碱(0.748)和苹果酸(0.714)，而主成分2的最大贡献成分为鞣花酸(0.911)。综上，通过UPLC-MS/MS测定结合9个成分的含量，发现胡芦巴碱、鞣花酸和苹果酸的含量相对较高，并且对聚类热图及主成分的贡献较大，同时箱型图的结果可知，3个成分在不同产地间具有明显的差异性，因此，胡芦巴碱、鞣花酸和苹果酸对使君子的质量评价可能具有重要意义。且这3个成分具有杀虫[4]、抗慢性病[26]、抗菌[29]、抗氧化[30]等作用，建议将其作为使君子的质控标志物。

本草考证和文献记载查证表明，使君子药用品种使用没有混乱，与现今《中国药典》收载的使君子一致，主产地为广东、广西、福建、四川等地，道地产区为四川眉州、合川和福建邵武[31-32]。本研究测定了福建、四川、广西、广东4个产区使君子药材中9个成分的含量，不同产区药材虽然基原一致，但是成分间含量存有差异，化学聚类存在明显区分。本研究建立的UPLC-MS/MS快速、灵敏度高，可以实现使君子药材多成分同时测定，并且筛选出胡芦巴碱、鞣花酸和苹果酸3个成分可作为使君子的质控标志物，为使君子整体质量控制和评价提供参考。