拉曼光谱技术识别不同病因脓毒症的潜力

杜 金 夏书香

1.延边大学临床学院，吉林延吉 133000；2.延边大学附属医院重症医学科，吉林延吉 133000

脓毒症是临床上非常紧急的一种医疗情况，最初定义为由感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及其所致的各器官功能障碍。由于原定义缺乏特异性和敏感性，脓毒症于2016年被美国重症医学会（Society of Critical Care Medicine，SCCM）联合欧洲危重病医学会（European Society of Intensive Care Medicine，ESICM）重新定义为一种由严重感染引起机体免疫反应失调导致的致命性器官功能障碍（即sepsis 3.0）[1-2]。该新定义将诊断重点从SIRS 转移到器官功能障碍，并加入了序贯器官衰竭评分（Sequential Organ Failure Assessment，SOFA），还提出快速序贯器官衰竭评分（quick Sequential Organ Failure Assessment，qSOFA）[2]，为临床医生识别脓毒症患者提供有效信息并指导有效治疗策略的实施。

1 脓毒症概述及其临床常用生物标志物

1.1 脓毒症概述

脓毒症是由各种病原体感染引起的严重疾病，感染源可以是细菌、真菌、病毒等病原微生物，其中由细菌感染所致脓毒症约占70%，病毒感染所致脓毒症约占20%，余下10%多为真菌感染[3]。脓毒症有着非常高的死亡率，若未及时采取治疗措施，将大大增加患者的死亡风险。有研究显示[1]，脓毒症患者接受有效治疗的时间每延迟1 h，死亡率将增加5%～10%。因此，临床上需要对不同病因所致脓毒症作出快速识别，以尽早对患者采取有效管理。

如今，脓毒症已成为世界上导致感染患者死亡率增加的主要原因之一，也是目前重症监护病房（intensive care unit，ICU）面临的一大难题，特别是其诱发的脓毒性休克和多器官功能障碍综合症（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），已成为ICU 内危重患者的主要死亡原因[4]。由于临床上缺乏针对脓毒症的特异性指标，目前仍以耗时较长的实验室检查来辅助确认患者是否存在潜在感染，因此临床上迫切需要一种快速、高效的检测方法，以尽快明确脓毒症及其潜在原因。

1.2 临床常用辅助诊断脓毒症的生物标志物

由于脓毒症大多由病原微生物感染所致，故目前临床上大多通过血培养确定病原体种类以明确脓毒症病因，同时为脓毒症患者的诊断及治疗提供有效信息，但由于血培养耗时较长，容易对患者接受治疗的时间造成延迟，还易出现假阳性和假阴性结果[5]，因此临床上常联合降钙素原（procalcitonin，PCT），C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和外周血白细胞（white blood cells，WBC）等多种生物标志物辅助诊断脓毒症。

PCT 是临床上常用于辅助诊断脓毒症的可靠生物标志物之一，与非脓毒症患者比较，脓毒症患者的血清PCT 值明显升高，故血清PCT 值持续升高可提示存在脓毒症。此外，在脓毒症不同发展阶段血PCT值也不相同，脓毒症早期血PCT 水平较低，而在脓毒性休克等严重阶段血PCT 水平则明显升高[6]。尽管如此，在最新的“拯救脓毒症运动（surviving sepsis campaign，SSC）”指南中指出，PCT 可用于诊断感染但不能识别脓毒症病因[7]，其在脓毒症中最主要的作用是指导抗生素的合理使用。

CRP 也是临床上常用于辅助检测感染及脓毒症存在的生物标志物，它是一种急性反应蛋白，由炎症及组织损伤后产生的细胞因子诱导肝脏产生，一般在感染后的4～6 h 内开始逐渐升高。但其缺乏特异性，即在某些非感染情况下体内CRP 水平也会升高[8]。

WBC 计数与分类因检测价格低、 检测速度相对较快，也成为目前诊断感染性疾病的常用指标，其中以中性粒细胞占主要地位。研究发现[9]，该感染指标易受到许多因素干扰，比如严重的组织损伤、血细胞破坏、急性中毒、急性大出血、血液系统疾病以及某些物理、化学因素损伤等都会影响体内WBC 的数量变化，使其在早期识别脓毒症方面有一定局限，无法做出准确识别。

2 新型分子检测技术——拉曼光谱

2.1 拉曼光谱的技术原理

拉曼光谱由印度物理学家Raman[10]于1928年观测到，因此该技术被命名为“拉曼光谱”。拉曼光谱技术是一种利用单色光源照射被检样品，通过探测入射光与被检样品分子之间产生的非弹性散射来反映不同样品的分子结构及组成，进而对不同种类的病原微生物做出快速区分的新型分子检测技术[11]。由于不同分子在光照后吸收的能量不同，故振动产生的光谱强度也不相同。光谱强度的高低与样品中所含分子的浓度密切相关，分子浓度越高，呈现的光谱越强，提示该分子的可能性也就越大[11]。拉曼光谱技术正是根据不同分子产生的不同强度的特征性光谱对其做出识别的。

2.2 常用新型拉曼光谱技术——表面增强拉曼光谱

由于光子发生非弹性散射的概率非常低，大约每106 个光子中才出现一个非弹性散射[12]，使得普通拉曼光谱技术产生的信号通常很弱。20 世纪70年代，Fleischmann 等[13]在测量吡啶在粗糙银电极上的拉曼散射时偶然发现，吸附在粗糙金属表面的分子可以显著增强原本微弱的普通拉曼光谱信号，信号强度甚至可增至原来的百万倍，并能检测出吸附于金属表面的单层物种。基于这一发现，表面增强拉曼光谱（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）技术便初步建立起来，成为一种新型的拉曼光谱技术。此后，研究人员相继研发了其他不同类型的新型拉曼光谱技术来增强普通拉曼光谱的信号强度，但SERS 是最常用的新型拉曼光谱技术之一[14]。

SERS 通过利用金属粗糙表面或向样品中加入金属纳米颗粒来增强普通拉曼光谱信号[15]。研究常用的金属材料有金和银两种，两者各有优缺点：金不易被氧化，但利用金增强拉曼信号的程度比银弱；银增强拉曼信号的程度比金强，但容易被氧化[16]。SERS 在研究中识别样品分子的方法有两种：无标记检测和使用SERS 标签的间接检测[17]。研究表明[18]，SERS 能够对侵入人体的病原微生物进行快速识别和区分，并可分别对存活和死亡的细菌种群进行量化。

3 拉曼光谱技术识别不同病原体所致脓毒症的潜力

3.1 识别细菌所致脓毒症的潜力

临床上引起脓毒症的细菌类别有很多，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等，其中金黄色葡萄球菌是导致脓毒症的重要感染性因素之一，可产生各种毒力因子，且常分离出耐药性金黄色葡萄球菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[19]。Potluri 等[20]开发了一种SERS 纳米标记结合聚合酶链反应的MRSA 鉴别方法，结果表明基于SERS 的检测方法具有时间短、灵敏度高的优点。Ciloglu 等[21]利用SERS 结合机器学习技术对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌以及嗜肺军团菌（对照组）做出研究，最终证明SERS 结合机器学习技术是一种有效区分敏感细菌的可靠方法。此外，在Ho 等[22]的研究设计中通过镀金的二氧化硅基质获得细菌细胞拉曼光谱，采用最先进的卷积神经网络图像分类技术对30株细菌分离株进行区分，得出拉曼光谱技术在鉴别细菌方面有着较高准确度的结论。Kim 等[23]采用SERS 功能化底物对7 株大肠埃希菌分离株进行了鉴定，验证了拉曼光谱技术对未知大肠埃希菌亚型进行快速分型的可行性。Wang 等[24]开展了一项在SERS 基础上使用硼酸功能化的多巴胺包被的Au@Ag 纳米颗粒作为探针检测致病菌的研究，该研究于30 min 内便对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、痢疾志贺菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌作出分类。

3.2 识别真菌所致脓毒症的潜力

除细菌外，念珠菌、霉菌等真菌也是导致脓毒症发生的常见病原微生物。Hu 等[25]在研究中使用预先制备的Fe3O4@PEI（PEI 为聚乙烯亚胺）与带正电荷的银纳米颗粒（AgNPs+）联合SERS 用于念珠菌的检测，采用正交偏最小二乘判别分析作为多因素分析工具直接从血清中鉴定念珠菌，而不是破坏细胞壁从真菌体内提取DNA 检测，经验证，该方法具有良好的分类能力，能够明确区分常见念珠菌，也是首个直接从血清中鉴定真菌的方法。Strycker 等[26]开发了一种利用785 nm 偏移激发拉曼差异技术结合神经网络的模型对10 种具有医学重要性的霉菌分生孢子的拉曼光谱进行检测，最终成功对研究中的霉菌分生孢子的拉曼光谱作出了快速、准确的鉴别。

3.3 识别病毒所致脓毒症的潜力

病毒性脓毒症常见病原体有流感病毒、 冠状病毒、疱疹病毒、肠道病毒等。Asif 等[27-28]在利用SERS检测SARS-CoV-2 的研究中表明，拉曼光谱技术在鉴别病毒方面具有很大潜力，可作为快速检测各种病毒的有效工具。Lim 等[29]的研究通过SERS 获取病毒感染细胞的拉曼光谱信号，采用PCA 分析不同病毒拉曼光谱的关键特征，最终成功区分了由不同流感病毒感染的细胞。Dou 等[30]演示了一种基于纳米级拉曼和红外光谱的新型检测方法，这种双峰成像方法可以提供不同但互补的复杂生物标本的结构信息，有助于病毒种类的快速鉴定。Wang 等[31]将Fe3O4@Ag 纳米颗粒作为磁性SERS 纳米标签制作了基于SERS 的生物传感器，以高灵敏度快速完成了甲型H1N1 流感和人腺病毒等两种呼吸道病毒的检测。此外，有研究表明，拉曼光谱技术还可能是定量研究宿主感染过程中活病毒和死病毒动力学的有力工具[32-33]。

4 展望

综上所述，拉曼光谱技术在识别不同病因所致脓毒症方面表现出强大的分析潜力及发展空间。尽管该技术可通过分析病原微生物的特异性光学特征明确脓毒症病因，但将其转换到临床环境中常规使用仍然是一个难题。解决这一难题的关键在于研制出一种成本低、便于操作且灵敏度高的振动光谱分析仪以及构建分子光谱数据库。目前，研究者们正在努力减少拉曼光谱技术对临床环境的种种要求，以推动该技术尽快应用于临床环境中。