外源褪黑素对低温胁迫下不同葡萄品种抗氧化酶活性和AsA-GSH循环的影响

苗卫东 王萌 高换超 井朋伟 李少东 樊秀彩

摘要：利用叶面喷施方法，探讨100 μmol/L外施褪黑素（MEL）溶液对低温胁迫下不同葡萄品种抗氧化酶系统和抗坏血酸-谷胱甘肽循环（AsA-GSH循环）的影响，以此推论MEL在葡萄受到低温胁迫时起到的作用。结果表明，外源MEL可以促进低温胁迫下葡萄抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量的积累，降低GSSG含量。长时间（7 h）低温胁迫下，外源MEL可以降低脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）含量，能够维持较高的AsA-GSH循环系统中抗坏血酸过氧化物酶（APX）、DHAR、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性。喷施外源MEL促进了低温胁迫下葡萄AsA-GSH循环快速而有效的运转，降低了低温胁迫对葡萄植株的氧化伤害，从而缓解了低温胁迫对葡萄幼苗的伤害作用。

关键词：葡萄;低温胁迫;外源褪黑素;酶活性;抗坏血酸-谷胱甘肽循环;抗氧化酶

中图分类号： S663.101  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）23-0133-06

收稿日期：2021-08-06

作者简介：苗卫东（1968—），男，河南遂平人，副教授，主要从事园艺植物栽培生理研究。E-mail：wangmeng991226@163.com。

通信作者：樊秀彩，硕士，研究员，主要从事葡萄遗传资源研究。E-mail：fanxiucai@caas.cn。

葡萄（Vitis vinifera L.）是我国及世界上的重要水果之一，但在葡萄栽培生产过程中常常遭遇低温胁迫。低温常常引起植物生理代谢紊乱，生长发育受到抑制，降低产量和品质。目前对低温胁迫的研究主要集中在膜伤害、光合、渗透调节物质、抗氧化酶活性等方面[1]。褪黑素（melatonin，简称MEL）是一种生物调节剂，它不仅在植物的正常生长和发育过程中扮演着必不可少的角色，而且它还可以通过提高抗氧化酶活性，降低活性氧（ROS）含量，提高植株抗性，以此缓解多种环境胁迫，如抗寒、干旱、盐渍、营养元素缺乏等[2-3]。

近年来，MEL介导植物对生物和非生物胁迫下的抗性研究越来越受到人们关注，已有研究表明，适宜浓度的MEL处理可以提高植物对低温的忍耐性，但效果卻因MEL处理的浓度、逆境类型及植物种类而异。抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环系统是植物体内清除活性氧自由基的重要途径，但关于MEL是否参与调节低温胁迫下葡萄体内 ASA-GSH 循环，缓解低温胁迫对葡萄植株的氧化伤害研究报道较少[4-5]。本试验选取砧木品种SO4葡萄（SO4 grape）、红提葡萄（Red Globe grape）和无核白葡萄（Thompson Seedless grape）3个葡萄品种的一年生盆栽自根苗为试验材料，研究外源MEL对低温胁迫下葡萄AsA-GSH循环的影响，为进一步研究外源MEL对葡萄植株抗低温胁迫能力的影响、MEL缓解低温伤害等方面提供一定的理论依据，为葡萄防寒管理提供一定的理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采集于河南科技学院葡萄种质资源圃（试验地点：35°16′ 56″N，113°55′ 49″E;试验时间：2021年3—9月）。以SO4葡萄、红提葡萄、无核白葡萄3个葡萄品种的一年生自根苗为试验材料，采用盆栽方式，盆口直径为30 cm、高为25 cm。每盆装沙壤土4.0 kg。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

盆栽苗长势良好后进行试验处理，每个品种随机选取10盆，每盆种植1株一年生自根苗，首先进行低温胁迫处理试验（-15 ℃），常温温度为25 ℃，24 h后取材测定各项指标，每个处理重复3次;然后09：00—10：00时采用100 μmol/L外施褪黑素（MEL）溶液进行叶面喷施，MEL溶液里添加0.5% Tween-20增加表面附着。叶面喷施 3 d 后，测定各项指标。试验设计4个处理：（1）对照，喷施清水后进行常温处理;（2）低温，喷施清水后进行低温处理，处理1、4、7、11、24 h;（3）MEL，常温的喷施MEL;（4）低温+MEL，低温处理的喷施MEL。从每个处理的植株中上部选取叶片3张，所采样品生长势及管理水平一致。

1.2.2 抗氧化酶系统中抗氧化酶活性的测定

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用SOD抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原法进行测定，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法进行测定，过氧化氢酶（CAT）活性采用高锰酸钾滴定法进行测定[6]。以上生理指标均采用北京索莱宝科技发展公司试剂盒进行测定，型号分别为BC0700、PR1400、BC1340，每个指标类型重复测定3次。

1.2.3 AsA-GSH循环代谢物指标的测定

还原型抗坏血酸（AsA）、氧化型抗坏血酸（dehydroascorbic acid，简称DHA）含量的测定采用二联吡啶法[7]。氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量的测定采用Nagalakshmi等的DTNB检测法[8]。抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）以及谷胱甘肽还原酶（GR）活性的测定参考Nakano等的方法[9]，单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性的测定参考Krivosheeva等的方法[10]。以上生理指标均采用北京索莱宝科技有限公司试剂盒进行测定，型号分别为BC1170、BC1160、BC0195、BC0650、BC1230、BC1180，每个指标类型重复测定3次。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对低温胁迫下不同葡萄品种抗氧化酶活性的影响

2.1.1 低温胁迫下不同葡萄品种抗氧化酶活性的变化

由表1可知，低温胁迫处理后，3个葡萄品种的SOD和CAT依然保持较高的酶活性，这可能是SOD和CAT保護酶活性的耐寒机制已形成，当处理7 h时，酶活性达到最高，与常温相比差异极显著（P<0.01），这是低温的一种适应性反应，使其比在常温下能更有效地清除体内的有毒物质，保护葡萄植株免受伤害或减少伤害。当低温胁迫7 h时，砧木SO4葡萄的SOD和CAT活性最高，分别达到（5.83±0.002 65） U/g鲜质量（FW）和（65.20±0.072 1） U/g 鲜质量。但到7 h后，3个葡萄品种的SOD和CAT活性均开始随着处理时间的增加呈下降趋势，说明随着低温处理时间的延长，葡萄植株有受冻害的可能，因此在葡萄栽植管理过程中，遇到低温胁迫时，葡萄品种、温度和时间都是必须要考虑的因素。随着低温胁迫时间的增加，3个葡萄品种的POD活性均呈逐渐下降的趋势，低温处理24 h，SO4葡萄的POD活性降低到（70.00±1.100 0） U/g FW，红提葡萄的POD活性为（46.67±0.115 3） U/g FW，无核白葡萄的POD活性仅为（41.67±0.085 4） U/g FW。说明随着低温胁迫时间的延长，抗氧化酶的活性受到破坏，葡萄植株受到低温伤害。

2.1.2 褪黑素对低温胁迫下不同葡萄品种抗氧化酶活性的影响

由表2可知，在1～24 h低温胁迫时间内，喷施外源MEL，3个葡萄品种SOD和CAT活性均呈现先升高后降低的趋势，在7 h时酶活性达到最高，与常温相比差异极显著（P<0.05）;POD活性呈现逐渐下降的趋势。在低温胁迫的整个过程中，喷施外源MEL显著提高了SOD和CAT活性。喷施外源MEL降低了低温胁迫下的POD活性，说明喷施外源MEL在低温胁迫下可以提高葡萄SOD和CAT活性，抑制POD活性，说明喷施外源MEL可以增加葡萄植株体内抗氧化物酶活性，间接增加了抗氧化物质的含量，能有效地清除体内的自由基，提高葡萄植株抵抗低温胁迫的能力。

2.2 褪黑素对低温胁迫下不同葡萄品种AsA-GSH循环途径的影响

2.2.1 低温胁迫下不同葡萄品种AsA-GSH循环中酶活性和代谢物的变化

在抗坏血酸代谢中，APX以AsA作为电子供体，催化AsA与H2O2反应，达到分解H2O2的目的;MDHAR以还原型辅酶II（NADPH）作为电子供体，将单脱氢抗坏血酸（MDHA）还原为AsA;脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）在碱性条件下催化GSH使脱氢抗坏血酸还原酶（DHA）还原为AsA;谷胱甘肽还原酶（GR）是一种黄素蛋白氧化还原酶，能催化GSSG还原为GSH，从而使细胞内的谷胱甘肽库保持在还原状态。

由表3可知，低温胁迫过程中，随着处理时间的延长，3个葡萄品种APX、GR、DHAR和MDHAR活性呈现先升高后降低的趋势，而且低温7 h时极显著高于常温水平。低温处理7 h时，SO4葡萄中GR、DHAR和MDHAR活性分别达到（6.27±0.010 0） μmol/g、（10.86±0.020 0） μmol/g 和（6.27±0.026 3） μmol/g，而APX活性在红提葡萄中达到（18.48±0.050 0） U/g FW，是3个葡萄品种中APX活性最高的。值得注意的是，SO4葡萄中MDHAR活性在低温处理 4 h 时达到峰值，这比红提葡萄和无核白葡萄中MDHAR活性峰值提早3 h。结果表明，3个葡萄品种在抵抗低温胁迫过程中AsA-GSH循环中各种酶活性明显增加，且SO4葡萄的增加幅度更大。但超过7 h低温胁迫后，3个不同葡萄品种APX、GR、DHAR和MDHAR活性开始出现下降，说明低温胁迫一定时间内，葡萄自身会启动体内AsA-GSH循环系统中的酶活性，提高防御能力，但是随着低温胁迫时间的延长，这种能力会下降，AsA-GSH循环系统中APX、GR、DHAR和MDHAR活性下降。

低温胁迫期间3个葡萄品种的AsA和GSH含量及GSH/GSSG比值的变化与酶活性变化一致，均表现为先上升后下降的趋势，而氧化型谷胱甘肽含量则为逐渐下降趋势，低温处理24 h后，SO4葡萄、红提葡萄和无核白葡萄分别降低到（4.03±0.034 6） mmol/g FW、（2.21±0.030 0） mmol/g FW和（2.05±0.020 0） mmol/g FW。3个葡萄品种的AsA和GSH含量在低温胁迫7 h时达到最大值，与对照相比差异极显著。3个葡萄品种中SO4葡萄的AsA含量、GSH含量以及GSH/GSSG值最高，分别达到（3.13±0.034 6） mmol/g FW、（4.27±0.052 9） mmol/g FW和57.74%;其次为红提葡萄，该品种的AsA含量、GSH含量以及GSH/GSSG值分别为（2.89±0.0557） mmol/g FW、（1.21±0.036 1） mmol/g FW和45.66%;无核白葡萄的AsA含量、GSH含量以及GSH/GSSG值最低，依此为（1.55±0.0346）mmol/g FW、（1.01±0.036 1） mmol/g FW和39.15%。说明低温胁迫期7 h之前，3个葡萄品种中的AsA含量和GSH含量增加，GSSG含量降低，促使AsA最大程度地保持在还原状态，有利于增强葡萄幼苗抵抗低温胁迫的能力，而随着低温胁迫时间的延长，AsA-GSH循环系统中APX、GR、DHAR和MDHAR活性降低，GSH含量和GSSG含量降低，促使AsA含量下降，葡萄会受到低温伤害。

2.2.2 褪黑素对低温胁迫下不同葡萄品种AsA-GSH循环途径的影响

GR、DHAR、MDHAR对维持AsA-GSH循环的有效运行具有重要的作用。由表4可知，低温胁迫下喷施外源MEL，APX、GR、DHAR和MDHAR活性在7 h前逐渐增加，随后快速下降。低温胁迫1～11 h时喷施外源MEL，APX、GR、DHAR、MDHAR活性显著高于常温。喷施外源MEL在低温胁迫7 h时，SO4葡萄中DHAR和MDHAR活性均高于红提葡萄和无核白葡萄，分别达到（12.11±0.040 0） 、（8.50±0.043 6） μmol/g;而APX和GR活性在红提葡萄中最高，分别达到（29.33±0.045 8） U/g FW和（8.93±0.026 5） μmol/g。说明施用外源MEL能保持相对较高的APX、MDHAR、DHAR和GR活性，增强植株对H2O2等活性氧的清除能力。

GSH不仅是一种抗氧化物质，而且是脱氢抗坏血酸还原酶（DHA）的电子供体，能清除生物体内的自由基从而解除毒害，它通过AsA-GSH循环可加快AsA再生[1]。在低温胁迫时喷施外源MEL处理期间，3个葡萄品种中AsA含量、GSH含量、GSSG含量和GSH/GSSG值的变化均表现为先上升后下降的趋势。低温胁迫中喷施外源MEL增加了AsA、GSH、GSSG含量，其中低温胁迫7 h时施加外源MEL，AsA、GSH、GSSG含量和GSH/GSSG值达到最大，与对照相比，效果差异极显著（P<0.01）。3个葡萄品种中SO4葡萄的AsA、GSH、GSSG含量及GSH/GSSG值最高，分别达到（4.67±0.062 4）、（5.67±0.026 5）、（9.16±0.045 8） mmol/g FW和61.90%;其次为红提葡萄，该品种AsA、GSH、GSSG含量以及GSH/GSSG值分别为（3.99±0.020 0）、（2.33±0.036 1）、（4.67±0.045 8） mmol/g FW和49.89%;而无核白葡萄的AsA、GSH、GSSG含量以及GSH/GSSG值是3个品种中最低的，仅为（3.00±0.026 5）、（1.79±0.026 5）、（4.33±0.010 0） mmol/g FW和41.34%。可見，低温胁迫下喷施适量MEL可显著提高GSH含量，降低GSSH含量，导致GSH/GSSG的比值明显提高。说明喷施外源褪黑素可通过提高AsA-GSH循环系统的代谢活动，减轻活性氧对葡萄幼苗的伤害，从而提高葡萄抵抗低温胁迫的能力。

3 讨论与结论

低温胁迫会影响植物的光合作用和能量的产生，导致物质合成受阻，细胞内活性氧积累，代谢失衡从而引发膜脂过氧化、电解质失衡、细胞代谢紊乱等[2，11]，严重时会导致植物死亡。面对胁迫植物可以调动自身的抗氧化防御机制，产生SOD、CAT、POD、APX、GR、DHAR、MDHAR等抗氧化酶以及AsA、GSH等抗氧化剂[7-10]，通过直接或间接途径还原积累的活性氧[9]，从而减少低温对植物造成的伤害。

本试验主要探究低温胁迫下外源施用MEL对不同葡萄品种常规抗氧化酶及AsA-GSH循环代谢系统的影响，结果发现低温处理的3种葡萄，SOD、CAT、POD活性随处理时间的延长均呈现先升后降的趋势，这与郑春芳等的研究结果[5]一致。这可能是由于在胁迫初期，低温作为信号，启动了植物的应激反应，而在胁迫后期低温降低了抗氧化酶活性，大量积累的活性氧诱导丙二醛（MDA）等有毒代谢物质大量产生，进而抑制了保护酶的活性。喷施外源MEL的葡萄，遭受低温胁迫后SOD、CAT、POD活性与未喷施MEL的处理相比也呈现相同的趋势，但是酶活性均高于低温处理植株，这也在其他研究[12-15]中被证明，说明施用外源MEL可以提高SOD、POD、CAT这些常规抗氧化酶的活性，通过减少细胞膜脂过氧化，保持细胞膜完整性进而有效降低低温对葡萄植株造成的伤害。

AsA和GSH可以维持蛋白质的稳定性，生物膜系统结构的完整性及防御膜脂过氧化，与APX、DHAR、MDHAR、GR共同构成了能有效清除自由基的循环系统，即AsA-GSH循环，在抗氧化机制中发挥重要作用，在AsA-GSH循环中AsA借助APX的催化作用与H2O2反应，接受来自GSH的NADPH，把H2O2还原成H2O，同时自身被氧化形成MDHA，一部分的MDHA则在MDHAR的作用下被还原为AsA，重新参与AsA-GSH循环，而另一部分的MDHA通过再次氧化形成DHA，DHA又以GSH为底物在DHAR催化作用下重新生成AsA，而此反应所产生的GSSG在NADPH参与下又被GR催化还原成GSH[16-21]。在本试验中，低温胁迫初期，AsA-GSH系统中的抗氧化酶活性及非酶抗氧化剂含量呈上升趋势，胁迫后期整体又呈下降的趋势，呈现这种趋势的原因推测与SOD、CAT、POD活性变化规律相同。而施用100 μmol/L外源MEL，APX、DHAR、MDHAR、GR活性和AsA、GSH含量提高，GSH/GSSG比值提升，说明施用外源MEL提高了AsA和GSH含量，为AsA-GSH循环系统提供了充足底物，加速了活性氧清除效率，减轻了活性氧对膜脂的伤害，保持了细胞完整性，从而缓解了低温对葡萄的伤害，为葡萄防寒管理提供一定的理论依据和技术指导。

参考文献：

[1]曲凌慧，车永梅，侯丽霞，等. 低温胁迫对葡萄品种梅鹿辄和贝达活性氧代谢的影响[J]. 青岛农业大学学报（自然科学版），2010，27（2）：117-121，125.

[2]卞凤娥，唐翠花，邢 浩，等. 外源褪黑素对干旱胁迫下葡萄内源褪黑素及叶绿素荧光特性的影响[J]. 植物生理学报，2018，54（10）：1615-1623.

[3]Zetterstrom R C，Eijkman C，Sir Hopkins F G. The dawn of vitamins and other essential nutritional growth factors[J]. Acta Padiatrica，2006，95（11）：1331-1333.

[4]尹永强，胡建斌，邓明军. 植物叶片抗氧化系统及其对逆境胁迫的响应研究进展[J]. 中国农学通报，2007，23（1）：105-110.

[5]郑春芳，刘伟成，魏 龙，等. 外施褪黑素对低温胁迫下红树植物秋茄光合作用和抗坏血酸-谷胱甘肽循环的调控[J]. 植物生理学报，2019，55（8）：1211-1221.

[6]李小方，张志良. 植物生理学实验指导[M]. 5版.北京：高等教育出版社，2016：292.

[7]Jiang M Y，Zhang J H.Effect of abscisic acid on active oxygen species，antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlings[J]. Plant  and Cell Physiology，2001，42（11）：1265-1273.

[8]Nagalakshmi N，Prasad M N V.Responses of glutathione cycle enzymes and glutathione metabolism to copper stress in Scenedesmus bijugatus[J]. Plant Science，2001，160（2）：291-299.

[9]Nakano Y，Asada K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts[J]. Plant and Cell Physiology，1981，22（5）：867-880.

[10]Krivosheeva A，Tao D L，Ottander C，et al. Cold acclimation and photoinhibition of photosynthesis in Scots pine[J]. Planta，1996，200（3）：296-305.

[11]黄 娟，刘纪疆，高明华，等. 近30年伊宁县气候变化规律及其对冰葡萄种植可行性的影响[J]. 江苏农业科学，2021，49（15）：136-142.

[12]王 芳，王 淇，赵曦阳. 低温胁迫下植物的表型及生理响应机制研究进展[J]. 分子植物育种，2019，17（15）：5144-5153.

[13]郁万文，曹福亮，汪贵斌.低温胁迫下银杏活性氧代谢与膜伤害的关系[J]. 东北林业大学学报，2010，38（7）：46-48.

[14]丁红映，王 明，谢 洁，等. 植物低温胁迫响应及研究方法进展[J]. 江苏农业科学，2019，47（14）：31-36.

[15]雷雪峰，马爱生，李海翠，等. 8种禾本科牧草低温胁迫的生理响应及抗寒性比较[J]. 江苏农业科学，2019，47（9）：218-222.

[16]Tan D X，Manchester L C，Reiter R J，et al. Significance of melatonin in antioxidative defense system：reactions and products[J]. Neurosignals，2000，9（3/4）：137-159.

[17]Potters G，Horemans N，Bellone S，et al. Dehydroascorbate influences the plant cell cycle through a glutathione-independent reduction mechanism[J]. Plant Physiology，2004，134（4）：1479-1487.

[18]吴锦程，梁 杰，陈建琴，等. GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体AsA-GSH循环代谢的影响[J]. 林业科学，2009，45（11）：15-19.

[19]Wu X X，He J E，Ding H D，et al. Modulation of zinc-induced oxidative damage in Solanum melongena by 6-benzylaminopurine involves ascorbate-glutathione cycle metabolism[J]. Environmental and Experimental Botany，2015，116：1-11.

[20]韩 敏，曹逼力，刘树森，等. 低温胁迫下番茄幼苗根穗互作对其抗坏血酸-谷胱甘肽循環的影响[J]. 园艺学报，2019，46（1）：65-73.

[21]Nahar K，Hasanuzzaman M，Alam M M，et al. Exogenous spermidine alleviates low temperature injury in mung bean （Vigna radiata L.） seedlings by modulating ascorbate-glutathione and glyoxalase pathway[J]. International Journal of Molecular Sciences，2015，16（12）：30117-30132.