外泌体在影响肝细胞癌免疫反应中所起的双重作用

周秋君 魏申誉 柴世牵 曹毅 陶茂灿

肝细胞癌占原发性肝癌的75%以上，是全球癌症相关的第4大死因，由于肝癌具有较高的隐匿性以及缺乏可靠的早期诊断指标，大多数肝癌患者在首次确诊时已经处于晚期因而难以进行有效的根治性治疗，往往只能依靠于姑息性的药物治疗，而一线药物例如多激酶抑制剂索拉菲尼或仑伐替尼也仅能延长晚期肝癌患者3个月左右的生存期[1]。近年来，由于免疫治疗在黑色素瘤、非小细胞肺癌等癌症中的成功应用而备受关注。然而由于肝脏所固有的低免疫源性，导致肝癌在发生、发展中形成了免疫抑制性的肿瘤微环境，造成了较低的免疫治疗阳性反应率[2]。随着研究的深入，外泌体在肝癌中作为肿瘤细胞与免疫细胞间交流的一种重要方式而逐渐被人们认知，其在免疫抑制性信号传导、促进肿瘤微环境的形成以及促进肿瘤细胞免疫逃逸的过程中均扮演重要角色，故而有必要深入了解其在影响肝癌进展中所起的重要机制，以针对性的开发出免疫治疗新疗法[3]。

1 外泌体简介

外泌体是直径30～100 nm的膜性囊泡，几乎能够被所有种类的细胞所分泌，参与各种生理、病理过程，且通常能在各种体液包括血液、尿液、唾液等中被检测到[4]。外泌体负责细胞间信号交流，通过受体配体结合及内吞入靶细胞等方式进行，并且能够转运各种生物分子，比如蛋白质、脂质、mRNAs、非编码RNA包括长链非编码RNA、miRNAs以及环状RNA等[5]。由于外泌体微囊泡膜结构能够较好地保护核酸等遗传物质，使得外泌体所携带的生物学信息能够被用于监测肿瘤的发生、发展，有望成为良好的生物标志物。在肝癌中，已知的外泌体所介导的肿瘤生物学行为包括血管生成、免疫抑制、远处转移、耐药等[6]。

2 外泌体在肿瘤免疫中的双重作用

肿瘤细胞的生物学行为不仅仅取决于肿瘤细胞本身，也受到肿瘤细胞与其所处肿瘤微环境的相互作用的调节，而来源于肿瘤细胞与免疫细胞的外泌体共同调节了机体的免疫反应进程[7]。在肿瘤发生过程中，各类抗原呈递细胞（APC）包括树突状细胞（DC）、巨噬细胞等通过吞噬各种肿瘤抗原并将其呈递至主要组织相容性复合物（MHC）分子上并与T细胞特异性结合以启动免疫反应，此过程被称为免疫突触[8]。与此同时，也有证据表明APC会通过分泌拥有抗原呈递作用的外泌体来激活更多免疫效应细胞，并且被激活后的T细胞也会分泌外泌体以进一步促进抗肿瘤炎性反应[9]。然而，在肿瘤的发展过程中，肿瘤细胞也会通过直接或间接方式塑造免疫抑制性的肿瘤微环境，以此来逃避或抑制免疫细胞的杀伤作用。肿瘤细胞可以通过多种方式逃避免疫监视并诱导免疫耐受，其中就包括释放肿瘤细胞来源的外泌体（TEX）[10]。有趣的是，一方面，肿瘤细胞来源的外泌体由于自身呈递肿瘤相关抗原可以诱导、增强抗肿瘤免疫反应；另一方面，肿瘤细胞来源的外泌体也可通过各种细胞间通讯的方式抑制免疫细胞正常功能，例如诱导免疫细胞抑制性的表型生成以及通过信号传导启动免疫细胞程序性死亡[11]。

3 外泌体抗原呈递激活肝癌免疫反应

在肝癌中，无论是免疫细胞来源的亦或是肿瘤细胞来源的包含肿瘤抗原的外泌体均能通过抗原呈递的方式来诱导和增强机体抗肿瘤免疫反应，并且某些免疫细胞来源的外泌体对于肝癌细胞有直接抑制或杀伤作用。DC细胞作为最主要的抗原呈递细胞在T细胞的启动中扮演着不可或缺的角色，在吞噬肿瘤抗原后它能够释放表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ大分子的外泌体，进一步激活免疫反应[12]。有报道显示，来源于小鼠肝癌细胞系的TEX能够激活并促进DC细胞的成熟，提升其表面MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的水平，并且TEX与传统肿瘤细胞溶解产物激活DC细胞相比能带来更强的体内以及体外免疫反应[13]。另外，在原位肝癌小鼠中，TEX处理的DC细胞显著改善了肝癌肿瘤微环境：T效应淋巴细胞数量增多，IFN-γ水平提升，IL-10以及肿瘤生长因子β（TGF-β）降低。由此可见，TEX能通过激活DC细胞启动T细胞的免疫杀伤效应，为外泌体抗肿瘤治疗提供了崭新的临床应用前景。NK细胞是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞，之前有报道，肝癌细胞释放的外泌体包含应激诱导热休克蛋白（HSP），能够显著激活NK细胞并促进其杀伤肿瘤效应[14]。并且这种杀伤效应是通过NK细胞识别肿瘤细胞上自然杀伤细胞活化型受体（NKG2D）的配体来实现的。最近有研究发现，一些抗肿瘤药（如卡铂）在治疗肝癌的过程中能够诱导肝癌细胞释放包含HSP70的外泌体，由此增强了肝癌肿瘤免疫源性并激活了NK细胞[14]。除了TEX的免疫激活效果，免疫细胞源性的外泌体也能够起到抗肿瘤的效果。例如，巨噬细胞来源的外泌体如miR-223和miR-142，可通过细胞间交流的形式抑制肝癌中某些基因转录后蛋白水平的表达，抑制微管不稳定蛋白1和胰岛素样生长因子1的分泌及肝癌细胞的增殖[15]。另外，也有研究发现，HDAC6基因能够通过上调肝癌细胞TEX的miRNA let-7i-5p表达，从而抑制TSP1蛋白表达并占据CD47受体，最终阻断巨噬细胞中CD47-SIRPα通路介导的抗吞噬作用，从而抑制肝癌肿瘤发生[16]。以上研究均显示出肿瘤来源的外泌体作为肝癌免疫治疗增强肿瘤免疫源性的巨大潜力，有望于成为肝癌免疫治疗的肿瘤疫苗。

4 外泌体促进肝癌免疫逃逸

尽管在癌症发生过程中外泌体对于机体免疫系统的激活起到了一定的帮助，但是大量的研究表明，在肿瘤进展过程中，外泌体所产生的免疫抑制效应导致了癌症不可逆的进展，其中外泌体对于免疫细胞的调节作用至关重要[17]。

4.1 巨噬细胞 巨噬细胞通常是由外周血中单核细胞募集、分化而来，在肝癌肿瘤微环境的发生、发展中扮演了重要的角色。生理状态下，单核细胞通常会在2 d内发生凋亡，然而在肿瘤驱动的慢性持续性炎症状态下，单核细胞会被持续动员募集进入肝癌肿瘤微环境，从而促进肿瘤的发生、发展。近期的研究表明，肝癌TEX在单核细胞的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路中激活了Ras和细胞外信号调节激酶，阻止了半胱天冬酶的裂解，从而抑制了单核细胞的凋亡，进而促进了肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的募集[18]。另外，敲低试验验证了TEX是通过其装载的磷酸化受体酪氨酸激酶如磷酸化上皮生长因子和人上皮生长因子受体2激活MAPK通路的。此外，随着肝癌的进展，TAM逐渐由抗肿瘤的M1型巨噬细胞极化为促癌的M2型巨噬细胞，其中肝癌TEX所运载的ncRNA亦起到重要作用。有研究显示，肝癌细胞分泌lncRNA TUC339通过TEX细胞间交流方式运输至TAM中，促进了TAM向M2表型的极化[19]。在TAM中沉默TUC339可显著增加促炎细胞因子的产生、共刺激分子的表达以及细胞吞噬作用的增强，而过表达试验恰恰相反。此外，芯片技术显示TUC339在巨噬细胞中可通过与CXCR趋化因子受体结合、Toll样受体信号通路等发挥作用。最新的研究发现肝癌TEX中转录因子Sal样蛋白2能够上调miR-146a-5p的表达，并激活NF-κB信号通路、诱导促炎因子表达，从而重塑巨噬细胞表型，使其极化为M2型巨噬细胞[20]。由此M2型巨噬细胞上调了效应T细胞中PD-L1和CTL4的表达，促进了效应T细胞在肿瘤微环境内的耗竭，助长了肝癌肿瘤免疫抑制微环境。且内质网应激对于肿瘤细胞发挥免疫逃逸及药物抵抗有很强的促进作用。在衣霉素处理的肝癌细胞TEX中，miR-23a-3p被发现显著上调，并且与巨噬细胞中程序性死亡配体-L1（PD-L1）的含量呈正相关[21]。进一步研究表明，肝癌TEX来源的miR-23a-3p可通过PTENAKT通路上调巨噬细胞内PD-L1表达从而促进巨噬细胞死亡，并进一步抑制了CD8+T细胞以及IL-12的产生，从而促进了免疫抑制环境的形成。此外，有研究发现褪黑素可以通过抑制肝癌TEX中STAT3通路的激活来下调巨噬细胞中PD-L1的表达，并同时抑制了IL-6、IL-10以及TNF-α等在巨噬细胞中的表达，表明了褪黑素对于缓解肿瘤免疫抑制状态的潜在作用[22]。

4.2 T淋巴细胞与B淋巴细胞 T淋巴细胞可根据其功能分为CD4+和CD8+T细胞两大类，其中CD4+T细胞在肿瘤免疫中主要为辅助功能，负责抗体产生与释放、CD8+T细胞的激活，而CD8+T细胞主要负责识别与杀伤肿瘤细胞。然而，肿瘤来源的外泌体却能够通过抑制Th1反应来诱导CD4+CD25+的调节性T细胞产生（Treg）的生成，而效应T细胞PD-1、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子（TIM-3）等可诱导T细胞程序性死亡或进入休眠状态，从而逃避免疫细胞的监视功能[23]。大多数外泌体并非是通过被摄取的方式进入T细胞从而进行细胞间交流的，而是与细胞表面受体结合从而传导信号或调节T细胞功能[24]。也有部分外泌体通过间接地调节巨噬细胞表型转换，以M2型巨噬细胞诱导效应T细胞的耗竭或是通过抑制DC细胞激活从而阻断T细胞激活，这些研究上文均已列举过[20-21]。最近有报道显示，14-3-3ζ在肝癌细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中均有高表达，且其高表达与免疫激活抑制、免疫细胞增殖以及抗肿瘤功能相关[25]。在外周血CD3+T细胞中，14-3-3ζ高表达时PD-1、TIM-3、淋巴细胞激活基因3与细胞毒T淋巴细胞相关抗原4等抑制性受体显著升高，且其增殖和活动受到抑制。另外，肝癌中高表达14-3-3ζ的TEX可直接被T细胞吞噬，由此可证明肝癌细胞中14-3-3ζ通过外泌体的形式被转运到T细胞内，并且介导了幼稚T细胞向Treg细胞而非效应T细胞的分化偏移。此外，亦有报道称主要组织相容性复合物Ⅰ（MIC）A/B和视磺酸转录本1/UL16结合蛋白（RAET1/ULBP）家族在肝癌TED中显著富集，其中MICA和ULBP能够通过外泌体途径抑制NKG2D信号通路，从而削弱细胞毒性T细胞的肿瘤杀伤功能，且装载TGF-β的外泌体能够抑制CD8+T细胞的激活[26]。

B淋巴细胞是体液免疫的主要组成部分，其不仅能够分泌特异性抗体，也具有部分抗原呈递功能，其中调节性B细胞（Breg）在肝癌中与不良预后有着显著联系[27]。在肝癌患者的肿瘤组织中，TIM-1+Breg细胞的浸润水平显著升高，呈现CD5highCD24-CD27-/+CD38+的表型，这促进了免疫抑制细胞因子IL-10的过表达并显著抑制了CD8+T细胞的免疫活性。而经过肝癌TEX处理后的B细胞也呈现出了相同的表型，这些都与肝癌晚期分期及早期复发相联系。进一步研究显示，外泌体来源的HMGB1激活了B细胞并可通过TLR2/4及MAPK通路诱导其表型转换及扩增[28]。

5 外泌体相关肝癌免疫治疗的方法及进展

针对外泌体相关肝癌免疫治疗方法包括诱导、增强机体自身免疫力，以及通过药物阻断免疫抑制相关通路。由于肿瘤来源的外泌体能够显著增强肿瘤免疫源性，激发相关抗原呈递细胞活化，因此一系列通过肿瘤细胞来源或免疫细胞来源的外泌体诱导免疫增强的试验已经展开[13，29-30]。其中呈递甲胎蛋白（AFP）的DC细胞来源的外泌体（DEXAFP）在异位、原位及诱导肝癌小鼠模型中均产生了较强的抗原特异性免疫反应，并抑制了肿瘤生长，延长了生存时间，小鼠肝癌肿瘤微环境得以明显改善，表达IFN-γ的CD8+T细胞明显增加，IFN-γ及IL-2水平也均明显增加，并且CD25+Foxp3+Treg细胞及IL-10水平在肿瘤组织中明显减少[29]。利用重组腺相关病毒载体携带AFP基因加载人外周血来源的DC细胞，制备出高纯度DEXAFP[30]。DEXAFP能够有效刺激naveT细胞增殖并诱导T细胞激活为抗原特异性细胞毒性T细胞，有效抑制肝癌生长。这两项研究均提示DC细胞来源的外泌体有望成为免疫疗法中的肝癌疫苗。

近期，一项关于肿瘤细胞来源的外泌体PD-L1的研究提示，来自肿瘤细胞的外泌体PD-L1能够抑制引流淋巴结T细胞的活化，而去除外泌体PD-L1可抑制肿瘤生长，即使在抗PD-L1抗体的模型中也是如此，这项研究尽管未在肝癌细胞系中展开，但也提示外泌体PD-L1可作为一种有效的抗免疫检查点抑制剂耐药的方法[11]。

6 小结

综上所述，外泌体作为一种新型细胞间通讯方式，在肿瘤细胞及机体免疫细胞的相互作用中扮演了不可替代的角色。外泌体能够有效激活机体免疫系统中的抗原呈递细胞，促进抗肿瘤免疫反应，为外泌体抗肝癌治疗提供新思路，为无细胞肝癌疫苗的诞生奠定了基础。同时，外泌体在肝癌免疫抑制微环境的塑造过程中起到促进肝癌发生、发展及转移的作用，本文详细阐述了肝癌患者外泌体对于几种主要免疫细胞的影响机制，并揭示了它们在肝癌进展中起到的作用。在未来的研究中，应该更加注重对于外泌体在免疫抑制通路方面的研究，以获取更多潜在的针对性治疗靶点，更好地应用于临床实践。