油茶壳基活性炭固定化辣根过氧化物酶*

郝红英，刘丽娟，毕淑娴

(省部共建煤炭高效利用与绿色化工国家重点实验室，化学国家级实验教学示范中心，化学化工学院，宁夏大学，宁夏 银川 750021)

酶的固定化的正式研究始于上世纪六十年代，是将酶限制在一定空间范围内，使其仍能起催化作用并可以重复回收利用的一种技术。固定化酶相较于自由酶，有着可重复利用的特点，有益于降低生产成本，且经固定化的生物酶各方面的稳定性也有所增加。辣根过氧化物酶由于具有优异的热稳定性和耐酸碱性，常被用于工业含酚废水降解的研究[1]。

大部分的固定化方法都需要有一个合适的载体作为支撑材料，载体材料对于酶的催化性能也有一定的影响，固定化酶的载体材料选择通常具有以下要求：(1)材料本身无反应活性；(2)对酶的活性无影响；(3)具有良好的稳定性；(4)载酶量大；(5)价格实惠，材料易得；(6)耐酸碱腐蚀等。目前常研究的载体材料主要有无机材料、天然高分子材料、复合材料等[2]。

选用的油茶壳基活性炭的原材料油茶壳来源于我国南方广泛种植的榨油原料油茶。油茶壳的本质生物质，其组成以纤维素、半纤维素、木质素等成分为主，其可经炭化造孔等方式制备成为油茶壳基活性炭，具有较大的比表面积和丰富的孔道结构是油茶壳基活性炭的一大优点，对其改性制成油茶壳基活性炭磁性复合材料，可增强其固酶性能。油茶作为一种重要的油料作物，种植广泛，产量大，榨油剩余的大量油茶壳若能对其加以利用，可达到变废为宝的效果。并且将油茶壳基活性炭作为制备载体材料的原料，其良好的比表面积及其丰富的孔道结构和表面含有的一定数量的含氧官能团赋予了其优异的吸附性能，可以应用于催化剂载体的研究。

本文油茶壳基活性炭为原料的磁性复合材料，上磁性之后的载体材料固载酶之后从反应体系中分离出来更加高效，可提高材料重复使用率。

含酚废水是污染水体的一大主要污染源，如果可以通过实验室研究一种良好的固载酶对其中的酚类化合物进行降解处理，对固定化技术在工业污水处理上具有一定的指导意义，有利于绿色化工技术的发展进步。

1 实 验

1.1 材 料

油茶壳基活性炭、乙酸、壳聚糖、戊二醛、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。油茶壳基活性炭由湖南省林业科学院自制。实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 复合材料的制备

1.2.1 原料预处理

取适量1 mol/L的盐酸与油茶壳基活性炭混合均匀后，超声20 min，磁力搅拌2 h后水洗离心至中性，在80 ℃下烘干10 h。

1.2.2 AC-CTS的制备

将1.5%壳聚糖(CTS)和1.0 g油茶壳基活性炭(AC)按一定比例加入50 mL的小烧杯中，超声20 min后，磁力搅拌10 h后用纯净水反复离心洗涤多次至pH=7，在80 ℃下烘干10 h，制得AC-CTS[3]。

1.2.3 Fe3O4磁性粒子的制备

取3.28 g FeCl3·6H2O和2.86 g FeSO4·7H2O加入100 mL去离子水中，在油浴锅中以60 ℃为条件机械搅拌，缓慢滴加0.5 mol/L的NaOH至pH=9，超声20 min，将制得的Fe3O4磁性粒子用纯净水离心水洗至中性，在60 ℃真空烘箱中干燥10 h。

1.2.4 AC-CTS-Fe3O4的制备

将Fe3O4磁性粒子和1.0 g AC-CTS复合材料按一定比例加入小烧杯中，并分散于pH=7的磷酸盐缓冲液中，超声20 min，搅拌10 h后用蒸馏水反复离心洗涤多次，80 ℃烘干10 h，制得AC-CTS- Fe3O4。

1.2.5 AC-CTS-Fe3O4-GA的制备

将4%戊二醛(GA)和1.0 g AC-CTS- Fe3O4复合材料按一定比例加入小烧杯中，超声20 min，搅拌交联10 h后用蒸馏水反复离心洗涤多次，80 ℃烘干12 h，制得AC-CTS- Fe3O4-GA复合材料。

1.3 固定化辣根过氧化物酶的研究

1.3.1 制备交联载体

取用适量4%的戊二醛交联后的油茶壳基活性炭磁性复合材料进行HRP的固定，步骤如下：(1)称取载体材料0.015 g/份于10 mL离心管中，用pH=7的缓冲液离心洗涤载体材料2次，备用；(2)将缓冲溶液洗过的载体材料分散于990 μL相应pH值的磷酸盐缓冲液中，将离心管冷藏备用。(3)在离心管中加入60 μL 1 mg/mL游离酶液，将离心管置于摇床中低温下振荡4 h，离心取出上清液，将固载酶用pH=7的缓冲液洗涤2次后，冷藏待用。

1.3.2 HRP活性测定

HRP浓度可以采用沃辛通法测定。HRP的底物为苯酚溶液，氧化剂是H2O2，显色剂是4-APP(4-氨基安替比林)，用沃辛通比色法测定产物在510 nm波长处的吸光度值变化率KA510。底物苯酚充足条件下，酶浓度与吸光度值变化率呈一次线性关系。本实验采用沃辛通(Worthington)法测定辣根过氧化物酶的酶活力，将一个过氧化物酶单位(1U)定义为在规定底物浓度下每分钟分解1 μmol过氧化氢时所需的酶量[4]。

计算公式如下：

2 结果与讨论

2.1 AC-CTS-Fe3O4复合材料的表征

2.1.1 AC-CTS- Fe3O4复合材料的红外谱图

从图1 AC-CTS(a)、AC-CTS- Fe3O4复合材料(b)和AC-CTS-Fe3O4-GA载体材料(c)的红外谱图可得以下信息：(1)油茶壳基活性炭中的O-H键伸缩振动吸收峰和壳聚糖中的N-H伸缩振动吸收峰出现在3412 cm-1处；(2)C-H键的伸缩振动出现在3000 cm-1处；(3)C=O和C=C的伸缩振动峰出现在在1737 cm-1和1598 cm-1处；(3)通过对比a与b的红外谱图，在585 cm-1处是上磁性后Fe-O伸缩振动吸收峰[5]；(4)对比b和c的红外谱图，在1737 cm-1处出现了吸收峰强度增大的情况，这是因为壳聚糖的NH2与戊二醛的CHO发生Schiff反应而生成Schiff键(C=N)形成的吸收峰和未参与反应的戊二醛残余的C=O伸缩振动引起的。

图1 AC-CTS(a)、AC-CTS-Fe3O4(b)和

2.1.2 AC-CTS-Fe3O4复合材料的扫描电镜图

图2 油茶壳基活性炭(a～b)和AC-CTS-Fe3O4(c～d)SEM图

图2为油茶壳基活性炭(a～b)和AC-CTS-Fe3O4(c～d)的扫描电镜图。从图2a、b和图2c、d的对比可知，在50.0 μm下观察到油茶壳基活性炭表面为无序的凹凸不平沟壑状结构组成，而在500 nm下观察到活性炭表面均由菜花状的小颗粒堆积而成；而制备而成的油茶壳基活性炭磁性复合材料表面有许多微小颗粒附着在其表面，是四氧化三铁磁性微粒与AC-CTS结合形成，且有许多空隙，有利于固载酶。

2.1.3 AC-CTS- Fe3O4复合材料的光电子能谱图

图3是AC-CTS-Fe3O4(a)、AC-CTS-Fe3O4-GA(b)的光电子能谱图。从图3a和图3b对比可见，图3b中N1s(400 eV)的特征吸收峰的峰强度明显减弱，说明戊二醛成功和AC-CTS-Fe3O4交联。

表1 表面元素组成

2.1.4 AC-CTS- Fe3O4复合材料的XRD图

图4为Fe3O4、AC-CTS-Fe3O4复合材料的X-射线衍射谱图的对比图，对比a、b之后，可以看出来，Fe3O4和AC-CTS-Fe3O4复合材料的特征衍射峰基本上完全一致，说明制备而得的载体材料具有磁性，经与相关文献的Fe3O4粒子的XRD图对比，在2θ=30.1°、32.3°、43.2°、54.1°、57.5°、62.6°及74.3°均为Fe3O4的特征衍射峰[5]，制备出来的Fe3O4、AC-CTS-Fe3O4复合材料均存在相同的特征衍射峰，结果表明所制备的微粒是Fe3O4粒子，且表明AC-CTS-Fe3O4复合材料具有相应的磁性，成功制备出油茶壳基活性炭磁性复合材料。

图4 Fe3O4(a)、AC-CTS-Fe3O4(b)XRD图

2.2 固定化HRP的酶学性质研究

2.2.1 固载酶的热稳定性

通常温度会增大酶促反应速率，酶的蛋白质结构在高温下会发生变性，酶活性将引起降低。由图5可知，自由酶和固定化辣根过氧化物酶的最适反应温度均为50 ℃。相比于自由酶，固定化辣根过氧化物酶在20～60 ℃范围内均具有较好的催化活性，因此，固定化酶可以增加酶的热稳定性，具有良好的应用前景。

图5 反应温度对自由酶、固定化辣根过氧化物酶

2.2.2 固载酶的pH稳定性

酶本质是蛋白质，变化的pH会影响酶分子活性部位中催化基团与结合基团的解离状态，同时也影响着底物的解离状态，pH也会对蛋白质的结构产生影响。由图6可见，自由酶在pH=7.0时具有较高的催化活性；固定化辣根过氧化物酶的在pH为8.0催化活性高，且其在pH>7的条件下比自由酶活性大，但处于酸性条件时催化活性较低，可能是由于酸性反应体系影响了底物与酶蛋白的结合，降低了催化活性。

图6 pH对自由酶、固定化辣根过氧化物酶酶活力的影响

2.2.3 固载酶的操作稳定性

固定化酶的其中一个重要优点是利于回收和重复利用，通过测定固定化辣根过氧化物酶的重复使用时的吸光度值，由图7可知，固定化辣根过氧化物酶在重复使用7次后测得的吸光度值计算得到的相对活性仅为16.79%，原因在于洗涤过程中会有部分结合的酶分子脱落或者是载体材料的损失，且未洗涤干净的染料物质在固定化酶表面堆积，阻碍了酶与底物的结合，降低了催化活性。

图7 固定化辣根过氧化物酶的操作稳定性

2.2.4 固载酶的储存稳定性

如图8所示，在4 ℃的环境下，固定化辣根过氧化物酶随着储存时间的延长，相对酶活有所下降，在储存15天后，相对酶活剩余70%。

图8 固定化辣根过氧化物酶的储存稳定性

3 结 论

油茶壳磁性复合材料固载酶最适pH=8.0，在碱性反应体系中，固载酶具有更好的催化活性，有益于固载酶在碱性反应体系中的应用，而且适应pH范围更广泛。自由酶和固载酶的最适温度均为50 ℃，不过相较于自由酶，固载酶在20～60 ℃的温度范围内，催化活性相对来说更稳定一些，因此，固载酶较之于自由酶具有良好的热稳定性。油茶壳磁性复合材料固载酶储存15天后相对活性剩余70%。与自由酶相比，固定化酶具有可回收再利用的优点。油茶壳基活性炭磁性复合材料固载酶在重复使用7次后还有16.79%的活性。