CSFV与PRRSV检测方法的建立及应用

钱 坤

（天津市农业生态环境监测与农产品质量检测中心，天津 300402）

通过多重PCR技术进行CSFV与PRRSV检测分析，可以有效的确诊其具体的类型，分析其是否为单一性或者混合型的病毒类型。多重PCR技术在养殖行业中应用可以有效的满足临床大批量的检测要求，效果显著。

1 CSFV与PRRSV检测方法的建立

猪繁殖障碍性疾病是一种危害养猪场的严重疾病，给生猪养殖造成了严重的经济损失。此种疾病具有一定的传染性。而猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）两种病毒的临床症状较为类似，近些年存在多种病毒综合感染的问题，单纯的通过临床症状无法确诊。传统的技术手段检测周期长，在实验室以及进行临床上的大批量检测中无法满足实际的检测要求。

多重PCR技术也称之为多重引物PCR以及符合PCR技术手段，是通过在相同的PCR反应系统中添加两对及以上的引物，通过同时进行扩增处理产生多个基因片段PCR反应的方式进行检验，是现阶段在医学领域中常见的分子生物学检测手段。

此种方式检测灵敏性较高，具有节省材料、经费的优势，可以通过一次反应检测多个病院，适合多种病原体的缓和性感染检测，具有快速诊断的优势。通过PCR机械进行处理，可以同时检测三种病毒，此种方式在临床中应用效果显著。

2 CSFV与PRRSV检测方法的应用

2.1 方法

2.1.1 引物设计与合成。根据三种病毒标准参考毒株基因序列进行选择，选择保守基因，进行特异性引物设计，通过稀释，在-20℃环境中保存备用。

2.1.2 提取DNA以及RNA。通过对病猪组织样品研磨处理，加入适当的生理盐水进行摇匀，放在-20℃的环境中反复的冻融三次；将其放在8000rpm/min中进行3min的离心处理，获得上清液，将其放在1.5ml的灭菌离心管之中，根据要求进行操作，检测合格之后放在-20℃环境保存备用。

2.1.3 RNA病毒模板植被。选择提取好的病毒，根据反转录实际说明书进行三种病毒的处理，检测合格之后将其放在-20℃的环境中进行保存。

2.1.4 单项PCR检测方法建立。根据引物浓度，在退火温度条件之后通过反复的试验分析确定最佳的单项PCR最佳反应条件。

2.1.5 多重PCR检测方法建立。基于三种病毒的单项PCR反应为基础，优化PCR的各项条件。

2.1.6 PCR扩增条件优化。通过将提取DNA以及c DNA为主要模板，分别在50℃、52℃以及54℃、58℃、60℃温度状态中，根据标准要求进行扩增处理，达到优化退火温度参数的目的，确定其最佳的退火温度。

2.1.7 多重PCR灵敏性试验。过混合3种病毒核酸，通过ddH 20进行10倍稀释处理，通过模板进行PCR分析。

2.1.8 多重PCR特异性试验。通过优化操作体系、实验程序进行处理，通过三种病毒的混合物作为模板，将阳性与阴性进行对照分析，进行多重PCR进行处理。

2.1.9 重复性试验。构建多重PCR，通过反应体系以及程序进行重复性的检验，分析结果是否可靠。

2.2 结果

2.2.1 PCR扩增。通过单项、多重扩增检查，通过分析可以确定3对PCR扩增的目的条带大小符合预期，阴性对照并没有扩增出条带。

2.2.2 多重PCR退火温度优化。通过选择50℃、52℃以及54℃、56℃、58℃以及60℃的退火温度，进行多重PCR分析，根据结果确定在退火温度不同状态之下对最终的扩增结果并不会产生较大的影响。通过分析确定将54℃作为最佳的多重PCR退火温度。

2.2.3 灵敏性检验结果。通过优化处理的条件进行扩增10倍稀释的CSFV获得其最低检测量的结果为39.3pg；PRRSV 55.1 pg的c DNA和DNA混合液最低检测量分别为39.3pg、1.32pg.

2.2.4 特异性检验结果。根据已经优化的多重PCR反应体系进行特异性实验分析，通过结果可以发现其并没有扩增出条带，而CSFV、PRRSV混合模板则存在清晰的条带，其属于目的片段，表明PCR特异性特征良好。

2.2.5 重复性实验结果。构建多重PCR分析，了解不同时间段不同阳性样品参数信息，重复检测3次之后如果结果相同则表明多重PCR较为稳定。

2.2.6 多重PCR临床样品检测结果。分析母猪组织样品，根据操作进行多重PCR的检测分析，其结果如表1：

通过分析可以确定多重PCR检测结果与单一的RT-PCR检测结果相同。

3 结束语

多重PCR检测方法检测效果显著，具有敏感性高、重复性良好的特点。通过多重PCR方式进行检测分析，可以检测两种病毒单一状态或者混合感染。通过免疫组织化学方法进行处理，在检测中通过进行免疫组织的化学染色方式，结果精准可靠，可以有效检测两种病毒。