中草药灵丹草抗弧菌及其用于发酵饲料添加剂的研究

戴祥宇，李相安，何增国

中草药灵丹草抗弧菌及其用于发酵饲料添加剂的研究

戴祥宇1，李相安2*，何增国3

（1.复旦大学生命科学学院，上海 200000 ；2.青岛农业大学海都学院生物科技系，山东 莱阳；3.青岛海洋生物医药研究院海洋微生物工程研发中心，山东 青岛）

通过筛选产酶有益微生物菌株，对药用植物灵丹草进行发酵，并进行了发酵条件的摸索和优化。结果表明，从9种不同产地的灵丹草中筛选出了对弧菌抑制效果较好的样品，对副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌的最低抑菌浓度（MIC）均为0.133 g/ml。筛选出了一株枯草芽孢杆菌和一株地衣芽孢杆菌作为产酶发酵菌株，可使对副溶血弧菌的最低抑菌浓度降低50 %。验证了灵丹草对斑马鱼的安全性，以及抗弧菌的初步应用效果。

中草药；灵丹草；发酵；弧菌

中草药富含丰富的营养成分及药用成分，如：有机酸类、酶、多糖等。然而由于植物细胞壁的阻碍作用，有效成分难以释放出来。传统炮制加工技术并不能使有效成分充分释出，而微生物丰富的酶系统使之成为可能。微生物发酵过程中产生的各种酶类不仅能降解难溶的木质素、纤维素、半纤维素等基质，还能将药用植物中难利用的大分子物质分解成小分子物质。

灵丹草Laggera pterodonta（DC.）Benth.为菊科六棱菊属，又名臭灵丹，主要分布于我国的长江流域以南及西南部。该草药的民间应用广泛，主要用在治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、咽喉炎、支气管炎、疟疾等病。

本文就灵丹草抗弧菌性能及其作为饲料添加剂进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中草药

表1 不同产地灵丹草及其代码

1.1.2 试验菌种

表2 指示菌菌种及其染色

1.2 试验方法

1.2.1 灵丹草抑菌谱 选用取自昆明、丽江、西双版纳、梅州、亳州、赣州的9种灵丹草，粉碎后过30目筛，烘干，分别取20 g灵丹草粉末，加入150 ml无菌水在121 °C下灭菌20 min，制得0.133 g/ml的药液，取上清对表2中的指示菌进行抑菌试验，以牛津杯法观察抑菌圈，测量抑菌圈直径。

1.2.2 菌株筛选、鉴定及菌株产酶特性研究 从20份海水、土壤样品以及其他样品中分离产酶菌，分别用产酶的平板进行初筛和复筛，选出产酶性能高的菌株，进行鉴定，及菌种的溶血性测定。将所选菌株活化后，用移液器取10 μl菌液滴到血琼脂平板上，在37 ℃ 培养箱中培养过夜，观察菌落生长情况和溶血圈大小。

1.2.3 发酵条件优化 将灵丹草用粉碎机粉碎后，过30目筛待用。将发酵液上清做抑菌实验，以副溶血弧菌作为指示菌，以牛津杯法观察抑菌圈。（1）灵丹草对发酵菌种抑制作用试验：在500 ml锥形瓶中分别加入5 g、10 g、15 g、20 g、30 g灵丹草粉末，加入150 ml无菌水在121 °C下灭菌20 min。分别将10 μl药液涂在3种产酶菌的平板上，观察是否有抑菌圈。（2）菌液添加量试验：在500 ml锥形瓶中分别加入20 g灵丹草粉末，加入150 ml无菌水在121 °C下灭菌20 min。分别加入10 ml、20 ml、30 ml的B.subtilis LS7菌液，发酵96 h。用发酵液上清进行抑菌试验。（3）中草药添加量试验：在500 ml锥形瓶中分别加入10 g、15 g、20 g、25 g灵丹草粉末，加入150 ml无菌水分别在121°C下灭菌20 min。加入20 ml的菌液发酵72 h。用发酵液上清进行抑菌实验。（4）pH稳定性试验：将灭菌的灵丹草调至pH5，pH7和pH9，分别发酵。用发酵液上清进行抑菌实验。（5）发酵前后活性对比：在500 ml锥形瓶中分别加入20 g灵丹草粉末，加入150 ml无菌水在121 °C下灭菌20 min，加入20 ml菌液；将灭菌后的灵丹草加入170 ml无菌水作为对照，共同发酵72 h。发酵完成后取上清离心过滤，文火煎至100 ml，得到0.2 g/ml的灵丹草药液，用二倍稀释法进行抑菌试验。

1.2.4 动物试验 （1）动物安全试验：分别取灵丹草灭菌后和发酵72 h后的药液，稀释到0.2 g·ml-1、0.1 g·ml-1、0.05 g·ml-1，浸泡饲料投喂斑马鱼，以正常饲料投喂的斑马鱼作为对照。添加量约为每缸150 μl，每缸10条，三组平行，观察15 d后斑马鱼的生长状态和存活情况。（2）动物功效试验：分别将鱼缸里加入1 ml弧菌培养液使水中弧菌浓度在1 000 CFU/ml左右，分别以发酵前、发酵后不同浓度的灵丹草处理饲料饲喂斑马鱼。每缸10条，3组平行，15 d后测量水中弧菌数量的变化，生长状态、体重变化及存活情况。

2 结果与分析

2.1 灵丹草抑菌活性筛选

从表3可以看出，K1、K3、K4、X1样品对于三种病原弧菌都有明显的抑制租用。其中K4样品最为明显。

表3 不同产地灵丹草的抑菌圈直径 （mm）

注：NA: 无抑菌效果或抑菌圈小于8mm

测试K4的抑菌谱，结果如表4，发现其除对弧菌有抑制作用外，对金黄色葡萄球菌也有抑制作用。

表4 K4样品灵丹草最低抑菌浓度

2.2 发酵菌种筛选

从20份海水、土壤样品以及其他样品中，一共分离得到了86株菌，初筛得到25株菌，复筛得到3株产酶性较高的菌株。分别为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。3种均为益生菌，在国家农业部可允许添加的饲料菌种目录中，且均无溶血性。产酶特性如表5：

表5 产酶菌的产酶直径比

注：表中数值为菌液在产酶筛选培养基上点10 μl培养24 h的透明圈直径与菌落直径比

2.3 发酵条件优化

2.3.1 灵丹草对发酵菌种抑制作用 在500 ml锥形瓶中分别加入5 g、10 g、15 g、20 g、30 g灵丹草粉末，加入150 ml无菌水在121°C下灭菌20 min。分别将10 μl药液涂在3种产酶菌的平板上，观察是否有抑菌圈。如表6，B. subtilis LS7对于灵丹草药液耐受浓度较高，可用于发酵。

表6 灵丹草对发酵菌种的抑制试验

注：+为有抑菌圈；-为没有抑菌圈

2.3.2 菌液添加量试验 菌落变化见表7。虽然发酵液在发酵48 h时菌活数达到最大，但发酵72 h的发酵液上清比发酵48 h的发酵液上清抑菌圈大，说明菌产生次级代谢产物复合酶需要一定的时间。

表7 发酵过程中的菌落变化及抑菌效果

2.3.3 中草药添加量 抑菌结果见表8，得到20 g发酵组抑菌效果最好；25 g添加组可能过于粘稠，不利于液体发酵。

表8 不同灵丹草添加量发酵的抑菌效果

2.3.4 pH稳定性 不调节pH发酵时，发酵液始终保持在5.5左右。3种pH发酵组抑菌圈结果相同，证明pH对发酵影响不大。

2.3.5 发酵前后活性对比 发酵前最低抑菌浓度（MIC）为0.1 g/ml，发酵后的最低抑菌浓度为0.05 g/ml，抑菌效果提升一倍。

2.4 动物试验

2.4.1 动物安全性 15 d后斑马鱼的生长状态和存活情况见表9和表10。斑马鱼的生长状态和存活情况均为良好，无呆滞、厌食或者死亡现象。

表9 未发酵灵丹草安全性

表10 发酵后灵丹草安全性

2.4.2 动物功效性 在鱼缸里加入1 ml弧菌培养液使水中弧菌浓度在1 000 CFU/ml左右之后，记录斑马鱼的存活数量（见表11）。在有灵丹草的情况下，斑马鱼的成活率高于不添加灵丹草。浓度高的实验组存活率高于浓度低的实验组。添加发酵灵丹草的斑马鱼存活率高于添加未发酵灵丹草的斑马鱼7 %。

表11 动物功效试验

3 结论

本研究从9种不同产地的灵丹草中筛选出了对弧菌抑制效果较好灵丹草样品；筛选出了产酶效果良好的一株枯草芽孢杆菌，对药用植物灵丹草进行了发酵，使灵丹草有效成分充分释放，使对副溶血弧菌的最低抑菌浓度降低了50 %。同时与所用生产菌一起，形成复合微生物添加剂，在斑马鱼上验证了灵丹草的安全性，以及抗弧菌的初步应用效果。这也为后续在水产业中取得应用，抑制弧菌，用于替代抗生素的使用，减少耐药菌的产生，并为减少抗生素在水产中的残留打下基础。

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（2020–10–02）

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1007-1733（2020）12-0011-03