多时间点电针对腰多裂肌损伤大鼠HGF 及相关因子影响

李欣怡，李亚军，李祎琳，陈 莉，陈 洁，许 玥，张 莉*，刘 通*

（1.北京中医药大学，北京100029；2.河北省保定市第一中心医院，河北 保定071000；3.承德医学院，河北 承德067000；4.中国中医药出版社，北京100029；5.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州510000）

腰多裂肌是腰椎的最强稳定器，腰多裂肌损伤影响腰椎稳定。肌卫星细胞(muscle satellite cells,MSC)作为肌肉损伤微环境的重要干细胞，受到牵拉刺激被激活，促进损伤肌肉的修复[1]。 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)通过激活肌卫星细胞参与组织再生和修复[2]，它的特异性受体酪氨酸激酶c-Met 与HGF 结合而被激活，响应环境刺激促进组织重塑。 细胞性骨髓瘤样癌基因(cellularmyelocytomatosis oncogene, c-Myc)蛋白表达受生长因子影响，同样在参与细胞增殖活动中发挥重要作用[3]。因此，HGF 与c-Met、c-Myc 对于损伤微环境的改变值得探究。电针作为一种外源性刺激促进多裂肌损伤后修复[4]，观察电针委中穴后相关因子动态改变，可加深对损伤微环境的认识。 故本文通过复制建立腰多裂肌损伤大鼠模型，探究不同时间点电针干预对于腰多裂肌损伤后HGF、c-Met、c-Myc 的表达及组织修复的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF 级雄性SD 大鼠54 只，体质量为（300±20） g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006。 随机分笼并适应性饲养10 d，自由饮食普通饲料和水，明暗周期为12 h∶12 h，温度环境24 ℃，湿度40%～50%。 将54 只大鼠采用完全随机方法分为空白组、模型组、电针组，每组18 只。 根据干预时间点每组再分1 d、3 d 和7 d 3 个亚组，各组6 只。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 布比卡因盐酸盐(美国Sigma 公司， 批号：80-477-DK)；10% 水合氯醛(北京百诺威生物科技有限公司，货号：RH32027)；4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物技术有限公司，批号：90090525)；HE（苏木素-伊红）染色剂试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1121）；山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物科技有限公司，批号：SAP-9101）；兔多抗HGF 抗体、兔单抗c-Myc 抗体（美国Abacm 公司，批号：ab216623，ab32072）；兔多抗c-Met 抗体（美国Proteintech 公司，批号：25869-1-AP）；兔多抗β-actin抗体（北京博奥森生物试剂有限公司，批号：bs-0061R）；预染蛋白Maker（美国Thermo 公司，批号：26616）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：PC0020，P1200）；5X 蛋白上样缓冲液、RIPA 裂解液、ECL 超敏发光液（北京Coolaber 生物有限公司，批号分别为：SL1170，SL1010，SL1350）。

1.2.2 主要仪器 半自动化石蜡切片机(德国莱卡仪器有限公司，RM2245)；电热恒温鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司，SKP-02.600)；高速冷冻离心机（德国Eppendorf 有限公司，5810R）；超低温病冰箱（美国Thermo Scientific 公司，FORMA907）；全自动组织脱水机（德国徕卡仪器有限公司，ASP300S）；正置智能型显微镜及采集系统（奥林巴斯中国有限公司，BX53）；韩式电针仪（北京思盛达医疗器械中心，HANS200A）；凝胶成像系统仪（美国AI-phaInnoteeh公司）；电热恒温培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司，SKP-02.600）。

1.3 动物造模

模型组和电针组复制大鼠腰多裂肌注射布比卡因建立损伤模型[4]。首先，选用10%的水合氯醛溶液(350 mg/kg)进行大鼠腹腔注射麻醉，以消除疼痛反射为度。成功后将大鼠四肢固定，背部备皮后暴露下腰，一次性注射器紧贴L4-L5 水平脊柱双侧的4 点棘突旁进针，针到达骨面后回抽无血注射。 每处注100 μL 的0.5% 布比卡因溶液，时间≥3 s，旋转针头拔出，操作过程保持无菌，模型制作完成。

1.4 干预方法

（1）电针组：造模24 h 后，将大鼠固定在操作台上，暴露背部和双侧后肢，参照大鼠解剖图[5]和最新国家标准穴位图[6]，于大鼠膝关节背面正中取双侧委中穴干预。 针刺前用75%乙醇消毒，华佗牌0.25 mm×13 mm 一次性针灸针垂直刺入委中穴，连接韩式电针仪HANS-200A，2/100 Hz 的疏密波，电流强度1 mA，1 次/d，每次持续20 min。 （2）模型组：与电针组同步抓取、固定，不做其他处理。（3）空白组：不做任何干预，与其他两组大鼠同步取材。

1.5 取材

空白组、模型组和电针组分别于干预后1、3、7 d 同步取材。麻醉方式同动物造模，成功后将大鼠四肢固定，充分暴露腹部，先进行5 mL 以上的腹主动脉取血，再解开大鼠，将其俯卧暴露背部，固定四肢和头部，剪开大鼠背部皮肤，以镊子和组织剪剥离腰部筋膜，使腰骶部肌肉暴露，剥离开髂肋肌和最长肌，于L4-L5 锐性取下大鼠腰部的多裂肌，一侧放入4%多聚甲醛溶液固定，一侧迅速放入冻存管后投入液氮，待冷却后转移至-80 ℃冰箱。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 HE 染色观察腰多裂肌形态 大鼠腰多裂肌组织置于4%多聚甲醛溶液固定48 h，将每一块组织转移至单个的包埋盒中。脱水与透明后，浸蜡包埋。使用半自动切片机连续切片，将包埋好的蜡块至水中展片，后在载玻片贴上，制好的载玻片于45 ℃恒温箱中进行烘干。结束后将石蜡切片放入浸泡用的铁架，经二甲苯（Ⅰ、Ⅱ，分别15 min）浸泡脱去切片中的石蜡，再经由高浓度至低浓度（100%、95%、90%、80%、70%、50%，分别1 min）的乙醇浸泡，最后转移至自来水冲洗2 min。 浸泡苏木素5 min 染色，再自来水洗1 min。 分化液10 s，自来水清洗10 min。浸泡伊红染色液2 min。 将切片浸于梯度乙醇脱水，二甲苯透明。 封片自然阴干后即进行显微镜观察。1.6.2 免疫组化法染色测HGF、c-Myc 表达 石蜡组织切片制作成功后，放入3%双氧水中浸泡10 min，PBS 溶液浸泡3 次，每次3 min，置抗原修复液中加热，自然冷却1 h 后，PBS 溶液浸泡3 次，每次3 min。切片于20%蛋清20 min 孵育，PBS 溶液浸泡1 次，3 min。 加山羊血清孵育在37 ℃环境下20 min，结束后不洗甩干。滴加一抗，置于4 ℃孵育过夜。结束后移至室温下复温30 min，而后放入PBS 溶液浸泡3 次，每次3 min。 滴加二抗，37 ℃孵育20 min。 结束后于PBS 溶液浸泡3 次，每次3 min。 滴加试剂SABC，于37 ℃20 min，最后PBS 溶液浸泡3次，每次3 min。 显色：滴加DAB 显色液10 min，在显微镜下观察，显色即可自来水冲洗，蒸馏水再次冲洗。苏木素溶液中复染3 min。脱水、透明后封片，自然阴干后即进行显微镜观察，采集图像进行分析。

1.6.3 Western blot 测c-Met 含量 取出存放在-80 ℃的腰部多裂肌组织，放置于预先配置的蛋白酶抑制剂和RIPA 裂解液混合溶液。使用超声粉碎仪充分裂解腰部多裂肌组织，选用BCA 法测量样品蛋白含量，绘制标准曲线后测定蛋白原液浓度。 用5×上样缓冲液按1∶4 比例与蛋白原液、RIPA 裂解液混合，放置水浴锅中加热，100 ℃5 min 后迅速静置冰上降温。 电泳、电转后，将膜取出置于丽春红染色液中，若目标蛋白完整清晰，用TBST 将染色液快速洗脱。然后将其浸没于由脱脂奶粉与TBST 配置的封闭液中，常温下置于摇床上，缓慢摇动1.5 h。 将膜取出放置于稀释好的一抗（c-Met 按1∶500 稀释，选用脱脂奶粉与10×TBST 配置）中，4 ℃摇床孵育过夜，后室温TBST 洗膜。 结束后将条带放入配制好的二抗稀释液（1∶3 000 稀释，选用脱脂奶粉与10×TBST 配置）中，室温摇床上慢速孵育1 h，后TBST洗膜。 洗膜结束后将目标条带显影曝光，进行图像分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行数据分析。每组样本数据用“±s”表示，服从正态分布采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两比较方差齐时用LSD-t 检验，方差不齐用非参数检验。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色观察肌纤维形态结果

空白组肌纤维细长多核，粗细均匀，纵向分布紧密；胞核呈扁椭圆形且靠近肌膜。干预1 d 后，模型组肌纤维坏死变形，肌纤维间隙增宽明显，间隙分布大量炎性细胞；电针组肌纤维增宽，间隙较模型组缩短，浸润的炎性细胞减少。干预3 d 后，模型组肌纤维形态仍不规则，部分排列开始紧凑，但仍有肌纤维的碎片存在，且大量炎性细胞分布；电针组肌纤维较模型组形态均匀、排列规则，间隙仍有炎性细胞浸润。干预7 d 后，模型组可见新生的肌纤维，且纤维间较干预1 d 和3 d 的模型组间隙缩短明显，仍有部分炎性细胞分布；电针组新生的肌纤维融合，排列紧密，细胞核开始向新生肌纤维边缘迁移。 详见图1。

2.2 免疫组化测定HGF、c-Myc 阳性表达情况

图1 大鼠腰多裂肌HE 染色结果（×200）

2.2.1 各组大鼠腰部的多裂肌HGF 阳性表达比较 与空白组比较，模型组1 d 组大鼠腰多裂肌HGF阳性表达降低（P＜0.01）；模型组3 d 组、7 d 组差异均无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，电针组治疗1 d 后腰多裂肌HGF 阳性表达升高（P＜0.01）；电针组3 d 组和7 d 组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图2。

表1 各时间点大鼠腰多裂肌HGF 的平均光密度值（n=6，±s）

表1 各时间点大鼠腰多裂肌HGF 的平均光密度值（n=6，±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，&&P＜0.01

组别空白组模型组电针组1 d 组0.37±0.02 0.30±0.02##0.36±0.05&&3 d 组0.38±0.03 0.36±0.04 0.40±0.01 7 d 组0.34±0.02 0.36±0.09 0.37±0.03

2.2.2 各组大鼠腰部的多裂肌c-Myc 阳性表达比较 与空白组比较，模型组1 d 组腰多裂肌c-Myc阳性表达升高（P＜0.05），模型组3 d 组、7 d 组差异无统计学意义（P＞0.05），电针组1 d 组、7 d 组腰多裂肌c-Myc 阳性表达升高（P＜0.05 或P＜0.01），电针组3 d 组差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，电针组1 d 组、3 d 组腰多裂肌c-Myc 阳性表达差异无统计学意义（P＞0.05），电针组7 d 组表达升高（P＜0.01）。 见表2、图3。

图2 大鼠腰多裂肌HGF 阳性表达结果（×200）

图3 大鼠腰多裂肌c-Myc 阳性表达（×200）

表2 各取材时间点大鼠腰多裂肌c-Myc 的平均光密度值（n=6，±s）

表2 各取材时间点大鼠腰多裂肌c-Myc 的平均光密度值（n=6，±s）

注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，&&P＜0.01

组别空白组模型组电针组1 d 组0.20±0.01 0.24±0.02#0.25±0.04#3 d 组0.19±0.02 0.19±0.01 0.21±0.02 7 d 组0.18±0.02 0.18±0.01 0.23±0.03##&&

2.3 Western blot 检测c-Met 含量

与空白组相比，模型组和电针组各时间点腰多裂肌c-Met 表达量均降低（P＜0.01）；与模型组相比，电针组1 d 组、7 d 组腰多裂肌c-Met 表达量降低（P＜0.05），电针组3 d 组腰多裂肌c-Met 表达量升高（P＜0.01）。 见表3、图4。

表3 各取材时间点大鼠腰多裂肌c-Met 表达量（n=6，±s）

表3 各取材时间点大鼠腰多裂肌c-Met 表达量（n=6，±s）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，&P＜0.05，&&P＜0.01

组别空白组模型组电针组1 d 组0.54±0.03 0.31±0.02##0.28±0.02##&3 d 组0.48±0.03 0.24±0.02##0.36±0.02##&&7 d 组0.40±0.01 0.22±0.02##0.17±0.02##&

图4 各取材时间点大鼠腰多裂肌c-Met 表达量

3 讨论

多裂肌作为脊柱肌肉维持着腰椎稳定。 临床上许多腰痛患者通过MRI 检测到单双侧多裂肌萎缩[7-8]。由此可以看出，腰部多裂肌损伤后修复对于预防和治疗腰痛尤为重要。

本实验复制腰多裂肌损伤模型，一次性直接定量注射局部麻醉药0.5%盐酸布比卡因溶液，布比卡因具有肌肉毒性，可在不影响肌卫星细胞的情况下改变肌组织形态[4]。 HE 染色结果发现，模型组肌纤维破坏，提示造模成功。 干预后电针加速了多裂肌的恢复，出现新生肌纤维融合，电针在多裂肌损伤后的修复作用直观可见。 研究发现与腰多裂肌损伤后即刻干预和48 h 干预相比，24 h 电针干预的大鼠Myostatin、Myod、Foxol 和CDK4 表达改变差异更为显著，提示损伤后24 h 电针干预效果最佳[9-10]。在干预时间方面，研究发现与肾俞穴比较，电针委中穴对于骨骼肌损伤后早期有较好促修复作用[11]，故本实验选择干预后1 d、3 d 和7 d，以观察早期电针干预对腰多裂肌损伤修复的影响。

肌卫星细胞作为成体肌源干细胞，受环境刺激激活进行增殖分化以修复受损细胞，对骨骼肌损伤修复发挥重要作用[12]。 研究表明外源性注射HGF 到正常肌肉中可激活静息状态卫星细胞，将HGF 注射到受损肌肉中则可促进肌细胞增殖[13]。 HGF 对针刺的机械牵拉刺激较为敏感，可诱导肌卫星细胞增殖，促进骨骼肌损伤后修复[14-15]。本实验发现模型组多裂肌损伤早期HGF 表达降低，提示腰部多裂肌损伤影响HGF 表达，7 d 后表达增高可能与损伤多裂肌组织的自我恢复有关。电针组整体趋势均高于模型组，且不同时间点变化趋势提示干预3 d 后HGF阳性表达升高，由此提示HGF 对电针干预后的骨骼肌修复早期效果明显。

HGF 与特异性受体c-Met 结合激活肌卫星细胞，共同参与对组织损伤的重塑。c-Met 作为受体酪氨酸激酶参与细胞增殖，对骨骼肌发育和再生起着重要作用[16]。 研究发现，c-Met 在骨骼肌损伤组织的肌卫星细胞中有表达，可能是肌损伤后修复的关键蛋白[17]。本实验发现，模型组整体腰部的多裂肌c-Met表达量低于空白组，提示多裂肌损伤致该蛋白表达减少。干预后1 d、7 d 电针组c-Met 表达量低于模型组，干预后3 d 电针组高于模型组，且不同时间点变化显示3 d 表达量高，提示电针干预后3 d肌卫星细胞中的c-Met 增加，但随着腰多裂肌组织再生，肌卫星细胞减少致c-Met 减少。

c-Myc 参与细胞周期、细胞增殖等变化。 c-Myc蛋白在增殖细胞中的表达较高，随细胞分化而降低，并失去促进增殖的能力[18]。 c-Myc 的水平得以提高在很大程度上依赖于生长因子[3，19]。研究发现，HGF 诱导髓母细胞瘤细胞中的c-MycmRNA 和蛋白质水平。当被生长因子刺激时，c-Myc 迅速积累并在整个细胞周期中保持高含量[20]。本实验结果显示，模型组1 d 腰多裂肌c-Myc 阳性表达高于空白组，模型组3 d 和7 d 表达与之基本一致，提示多裂肌损伤早期刺激c-Myc 参与细胞周期、细胞增殖等活动。 电针组腰多裂肌c-Myc 阳性表达高于模型组，且不同时间点变化趋势显示1 d 表达较之高，提示电针干预多裂肌损失模型引起c-Myc 早期作用，促多裂肌损伤后细胞增殖，进而有助于损伤后的修复。

综上所述，本实验通过建立大鼠腰多裂肌损伤模型，观察电针委中穴后不同组间的HGF 及相关因子表达情况，发现电针委中穴干预早期大鼠腰多裂肌HGF、c-Met、c-Myc 均上调，促肌卫星细胞修复损伤的腰多裂肌。