EGCG 在UVA 致人成纤维细胞的细胞周期改变中的作用及其机制研究

裴冬，闵玮

（苏州大学第一附属医院皮肤科，苏州 215000）

人们对皮肤健康的迫切需求， 使得皮肤光老化的防治日益成为皮肤科学新兴的研究方向。 长波紫外线（UVA，320-400nm）因为能够穿透表皮层直达真皮层， 直接损伤人成纤维细胞（human fibroblasts，HFs）,是日光致皮肤老化最相关的成分[1]。UVA 可通过不同的信号通路引起皮肤细胞发生光老化[2-4]。 EGCG（epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯）是绿茶茶多酚的主要成份，因其抗氧化等功效为大众熟知， 自然界很多草本植物中富含该物质。 之前的研究发现EGCG 能够有效减少皮肤细胞因太阳辐射引起的氧化损伤和光产物形成[5-7]。 本研究将通过检测HFs 在EGCG和UVA 影响下细胞周期及相关调控基因的表达变化， 初步揭示EGCG 抗光老化和细胞机制的关系。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂 日光紫外线UVA 模拟器(上海 Sigma 公司)， 流式细胞仪 （美国 EPICS 公司），ABI7300 实时定量 PCR 仪 （美国生物应用技术公司），EGCG（中国药品生物制品检定所）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和UVA 照射 收集本院急诊外科手术室青少年包皮术后皮肤， 酶消化法分离HFs，在 37℃、5% CO2条件下， 用含 10%FBS 的 DMEM培养。0.25%胰酶和0.02% EDTA 消化传代，调整浓度至1×106/ml，定量接种于培养皿中。

细胞生长至亚融合状态时分为四组：Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ组为EGCG 组，Ⅲ组为UVA 组，Ⅳ组为UVA+EGCG 组， 第Ⅳ组中EGCG 在照光前 2h和照光后加入，使之达到 25μg/ml。 用 UVA 模拟器对置于PBS 里的Ⅲ、 Ⅳ组细胞进行照射， 剂量设置：10J/cm2。24h 后收集细胞，流式检测需要的细胞光照后72h 收集。 每组3 个复孔，重复实验3 次。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期 收集的细胞用75%乙醇固定。 PBS 洗3 次，加入4℃保存的含50 mg/L Triton 的碘化丙啶（PI）常温避光 0.5h，200 目滤网过滤后上机检测。

1.2.3 real -time PCR 检 测 p53、p16 和 c -myc mRNA 表达 操作严格遵循试剂说明书， 细胞总RNA 用 Trizol 试剂提取，-80℃冰箱冻存。 cDNA 合成 反 应 体 系 为 10μl：MgCl2（25mM） 2μl，10 ×RTBuffer 1μl，RNase Free dH2O 3.75μl，dNTP Mixture（10 mM） 1μl，PRNase Inhibitor ( 40U/μl) 0.25μl，AMV Reverse Transcriptase （5U/μl） 0.5μl，Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 0.5μl，实验样品 RNA 1μl。 反应条件为：42℃ 1h→99℃ 15 min→5℃ 5min。 -80℃冻存逆转录合成的 cDNA 备用。

PCR 扩增：p53 引物序列，上游引物 5’- TGCC CAACAACACCAGCTC-3’， 下游引物 5’- CCAAG GCCTCATTCAGCTCTC-3’；p16 引物序列，上游引物 5’- CTGCTTACGAATTTGCCGAC-3’，下游引物5’-GCAGCATCGATATGCTTCAC -3’；c-myc 引物序列,上游引物 5’- AGGCTATTCTGCCCATTT -3’,下游引物 5’- TCGTAGTCGAGGTCATAGTTC-3’。实时定量PCR 检测mRNA 表达，PCR 反应体系共20μl: 逆转录产物 2μl，2×QuantiTect SYBR Green I RT-PCR Master Mix 10μl；上游引物、下游引物（10 μmol/μl）各 0.5μl,终浓度为 0.15mol/μl；QuantiTect RT Mix 0.2μl； 无 DNAase 水 6.8μl。 反应条件为:95℃ 10min （1 Cycle），94℃ 15s→59℃ 20s →72℃30s（45 Cycle）测定吸光值。 相对含量% = 2–ΔΔCT，ΔΔCT=ΔCT处理组-ΔCT对照组。

1.2.4 统计分析 以SPSS 23.0 统计软件对实验数据进行组间单因素方差分析（One-Way ANOVA），当P＜0.05 时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG 对UVA 辐射后HFs G1 期细胞比率的改变 UVA 辐射致使细胞周期阻滞，是细胞损伤正常的反应机制， 然而长久的阻滞会不可避免引起细胞衰老。 实验结果表明，光照后 24h、72h，G1 期的细胞从空白组的59.94%分别增加到81.04%、89.09%，发生明显的 G1 期阻滞（P＜0.05）。而在照光后24h，EGCG 共孵育组的 G1 期 HFs 百分比为 75.32%，比 UVA 组明显减少（P＜0.05）。 证明 EGCG 确实能够减少UVA 导致的G1 期阻滞（见图1）。

图1 EGCG 和UVA 对细胞周期的影响

2.2 EGCG 对 UVA 辐射后 HFs p53、p16 和 c-myc mRNA 表达水平变化的影响 EGCG 组p53 和p16 mRNA 表达较第Ⅰ组不明显（P＞0.05）；而 UVA 照射后， 它们的表达水平显著增加 （P＜0.05）；UVA+EGCG 组p53 和p16 mRNA 表达水平较仅照光组显著降低（P＜0.05）。 另外，单纯 EGCG 处理使 cmyc mRNA 表达水平下降 （P＜0.05），UVA 照射使c-myc mRNA 表达水平降低幅度更剧（P＜0.05），加入EGCG 干预可使c-myc 表达较照光组轻度降低，但差异不明显（P＞0.05）（见图 2）。

3 讨论

细胞衰老有很多生物学表现， 可以通过很多方法检测，周期停滞是其中一个重要的特征。 本研究通过细胞周期来检测细胞的老化，并选择EGCG这一已被广泛证实的具有多种生物功效、 易于获取的成份来对HFs 的老化进行干预,观察其效应并探讨其可能的机制。 细胞内外各种信号可诱导周期停滞,而周期停滞信号的增加又可以诱导增殖细胞的衰老[8,9]。 本实验中 HFs 受到 10J/cm2UVA 辐射后发生显著G1 期阻滞， 从对照组的59.94%提升到81.04%，而EGCG+UVA 共处理后G1 期细胞比率仅为75.32%。 证明EGCG 能够显著减轻UVA导致的细胞周期阻滞， 抑制UVA 引起的细胞衰老，其机制可能与其抗细胞DNA 氧化损伤功能相关。

图 2 EGCG 和 UVA 照射对 p53、p16和c-myc mRNA 表达水平的影响

研究证实p53 在诱发细胞周期阻滞、 增殖性衰老及凋亡的信号通路中起着至关重要的作用[10]。p16 则参与直接调控细胞周期、负性调节细胞增殖及分裂，P16 蛋白通过抑制CDK4 干扰G1-S 转换[11-13]。 实验结果表明，光照明显促进细胞阻滞，并使p53 和p16 mRNA 升高，可能是通过基因途径促进了老化的发生； 而EGCG 共处理则减少了这种变化，可能与EGCG 抗肿瘤、促进老化细胞凋亡作用有关。 此外，c-myc 基因是一种促分裂、缩周期、让细胞不停增殖的基因，与肿瘤密切相关[14,15]。 实验中UVA 使c-myc mRNA 表达水平降低，影响细胞分裂， 与UVA 能够增加细胞周期阻滞相一致；而肿瘤细胞最显著的特点之一就是分裂加快、 不断增殖，UVA 抑制c-myc 引起的上述改变， 即抑制c-myc 途径可能引起的HFs 发生癌变， 提示衰老或许是细胞自身阻止瘤变的主动防护机制。 单纯EGCG 及辐射前后加药干预降低c-myc 表达，这也许是因为其熟知的抗肿瘤功能。 当UVA+EGCG 共同作用于细胞时， 可能UVA 引起的细胞衰老及EGCG 的抗肿瘤功能相互协同，使c-myc 表达进一步下降。 紫外线长期过量的照射引起的细胞癌变有可能是因为损伤的累积促使量变转化为质变。

总之，EGCG 能够明显减少UVA 诱导的细胞周期阻滞，证明其具有对抗光辐射老化的作用，机制可能涉及p53、p16 和c-myc 等老化相关基因表达的调控。