生物钟基因Bmal1与骨代谢相关性的研究进展

余明芳 刘旭光 吴晓

1西南医科大学中西医结合学院附属中医医院（四川泸州640000）；2泸州市中医医院针灸科（四川泸州646000）；3成都中医药大学（成都610037）

哺乳动物的许多生理过程，包括骨代谢，都受生物钟的调节。调控昼夜节律的生物钟由位于视交叉上核（SCN）的中枢钟和各种外周钟组成。昼夜节律产生的分子基础来源于生物钟基因之间的协调表达。目前主要的生物钟基因有：Clock、Bmal1、Pers、Crys、Rev-erbα、Ror 等。其中，Bmal1 是分子生物钟的核心调节器，因为它有能力刺激昼夜节律中的多种基因的转录，提供稳健的昼夜节律。

在骨骼中，已有文献研究认识到软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的代谢功能表现出内在的昼夜节律［1］。各种骨代谢指标和骨代谢调节激素显示有昼夜节律性。昼夜节律的紊乱会破坏骨代谢的动态平衡。骨骼动态平衡是一个内在的动态过程，其机制的复杂性不仅源于所涉分子的数量及其多方面的相互作用，还源于生物钟控制。昼夜节律的紊乱与骨代谢疾病（如类风湿性关节炎、骨关节炎和骨质疏松症）之间存在密切联系。据报道，在绝经后妇女中，夜间睡眠不足有更大的骨质流失风险［2］。与白天工作的工人相比，轮班工人的骨密度更低，骨折风险更高［3］。由此可见，昼夜节律在骨代谢中发挥着重要作用，而生物钟基因Bmal1 对于维持24 h 节律至关重要［4］。

1 核心生物钟基因Bmal1

Bmal1（brain and muscle ARNT-like-1）基因，是生物钟基因昼夜节律的重要元件，在细胞核内驱动节律性的昼夜转录。昼夜节律由生物钟基因之间形成的转录翻译反馈环维持。

CLOCK 和BMAL1 的编码蛋白构成的异二聚体是反馈环中的中心节点和反馈回路的转录启动子，它去激活转录靶基因启动子区域的所有E-box顺式元件，即PER、CRY 等。PER 和CRY 蛋白构成的二聚体PER/CRY 反过来抑制CLOCK/BMAL 1介导的转录。随后PER/CRY 的降解会释放其对CLOCK/BMAL1 的抑制作用，开始新的转录翻译循环。该环路通常被认为是昼夜节律的经典调控环路。另一个反馈环路中，通过CLOCK/BMAL1 异二聚体翻译出的ROR 和REV-ERB 蛋白分别作为激活剂和抑制剂参与Bmal1 的调控［5］。

2 骨代谢的细胞分子调控特点

骨的细胞在不停地进行细胞代谢，以维持骨的生长、发育及重建，即骨代谢。骨骼的发育和骨形态的终生维持涉及四种关键的细胞类型，包括软骨、成骨、破骨细胞及骨细胞，其中软骨、成骨、破骨细胞与Bmal1 密切相关。软骨细胞是发育过程中出现的第一种细胞类型，在早期胚胎发育中，间充质干细胞分化成软骨细胞，增殖并分泌含有弹性蛋白和Ⅱ型胶原的基质，形成软骨类似物。成骨细胞来源于多能间充质干细胞，主要功能是产生骨细胞外基质的有机成分，促进无机成分的矿化。破骨细胞起源于造血干细胞的单核-巨噬细胞前体分支，其负责骨吸收，对骨骼的正常发育、终生保持其完整性和钙代谢起着重要作用［6］。骨代谢需要骨骼系统不断的吸收和重建以维持体内平衡，骨重建由破骨细胞和成骨细胞组成，多种激素、细胞因子和生长因子在骨重建中起重要作用［7］。一旦平衡破坏，就可能发生各种骨代谢疾病，如骨发育不全、骨质硬化症以及骨关节炎等［8］。

3 Bmal1 通过调节软骨、成骨及破骨细胞影响骨代谢

3.1 软骨细胞Bmal1 指导许多涉及软骨稳态基因的昼夜节律表达，包括参与分解、合成和细胞凋亡途径的基因。软骨细胞内源性生物钟紊乱可能是骨关节炎早期病变的关键步骤。活化T 细胞核因子（NFAT）是骨关节炎（OA）的关键抑制因子。研究表明敲除Bmal1 会下调NFATC2 的水平，并下调主要软骨基质相关基因Sox9，Acan 和Col2a1 的表达［9］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NAD+）和沉默信息调节因子1（Sirt1）是人类膝关节软骨中细胞代谢基因，在OA 软骨中，NAD+的水平显著下调，导致烟酰胺磷酸核糖基转移酶活性和Sirt1 表达受到抑制。Bmal1 的敲除会降低IL-1β刺激下的NAD+水平，上调OA 相关基因的表达，Bmal1 的过表达则缓解了IL-1β引起的改变［10］。TGF-β信号传导对于维持软骨的代谢和结构完整至关重要，它有利于软骨细胞分化和软骨修复，其失调会导致软骨细胞合成代谢的活性降低，触发骨关节炎［11］，干扰软骨细胞中Bmal1 的昼夜节律会影响TGF-β信号传导［12］。

软骨细胞中Bmal1 基因缺陷会导致关节软骨节律失常，对关节发育产生不利影响。研究［13］证实，小鼠软骨细胞中Bmal1 的靶向敲除会导致膝关节软骨进行性退化，从3 个月大时开始，软骨细胞和细胞外基质就会明显丢失。Bmal1 敲除会显著抑制软骨细胞增殖并激活细胞凋亡的生长板。有实验观察到Bmal1 敲除小鼠在青春期表现出生长迟缓，整个生长板的长度和增殖区都比对照组短。敲除Bmal1 会抑制生长板软骨细胞中VEGF和HIF1α的表达，增强MMP13 和Runx2 的表达水平。与体内的发现一致，Bmal1 的敲除可能导致软骨细胞增殖减少，HIF1α和VEGF 的表达下调以及培养的软骨细胞凋亡增加［14］。Runx2 是促成骨细胞分化的重要转录因子，对软骨细胞成熟至关重要。非自然明相条件下饲养的Bmal1 敲除小鼠，其SCN 中Runx2 mRNA 无法检测，这表明Runx2 依赖生物钟基因Bmal1 的调控［15］。

3.2 成骨细胞Bmal1 在糖尿病性骨代谢疾病中具有潜在修复作用。在糖尿病骨髓间充质干细胞（BMSCs）中β-catenin 和T 细胞因子的表达下调，而糖原合酶激酶3β（GSK-3β）和nemo-like激酶（NLK）的表达上调。过表达的Bmal1可以通过下调GSK-3β的表达来激活Wnt/β-catenin 通路，部分恢复糖尿病中BMSCs 的成骨作用［16］。Bmal1 可通过调节成骨细胞MC3T3-E1 中骨形态发生蛋白2（BMP2）的表达来诱导成骨细胞分化。研究表明，Bmal1 的过表达增加了成骨基因的表达，包括DNA 结合抑制剂、Runx2 和骨钙蛋白，这些因子是BMP2 重要的下游因子。实验证实Bmal1 敲除细胞中胰岛素诱导的BMP2 表达下调［17］。

Bmal1 缺乏可引起骨量减少、骨量表型降低。Wnt 通路有促成骨分化功能，其核心因子β-catenin在衰老小鼠中表现出下调的表达。研究报道Bmal1 敲除小鼠表现出许多早衰的特征，例如骨量减少。有实验用慢病毒载体在NIH-3T3 细胞中介导Bmal1 过表达，发现Bmal1 过表达后，β-catenin在NIH-3T3 细胞中表达增加［18］。共培养实验表明，Bmal1 的整体敲除导致骨量下调、骨吸收增加。小鼠中缺乏昼夜节律基因Bmal1 会导致骨量表型降低。有报道Bmal1 敲除小鼠的骨质表型低，使用计算机断层扫描显示Bmal1 敲除小鼠的骨皮质和骨小梁体积以及其他微结构参数减少，且骨的矿物质密度下调。组织学显示Bmal1 敲除会诱导活性成骨细胞和骨细胞数量减少。从Bmal1 敲除小鼠中分离出的BMSCs 表现出体外分化为成骨细胞的能力下调［19］。

3.3 破骨细胞Bmal1 可通过与破骨细胞相关基因的相互作用来影响骨量。外周破骨细胞生物钟有助于驱动破骨细胞相关基因的表达，如组织蛋白酶K（CTSK）和NFATc1。NFATc1 是调节破骨细胞终末分化的主开关，组织蛋白酶K 是破骨细胞活动增强的标志。研究发现与Bmal1 蛋白相互作用的E-box 元件分别结合在CTSK613/NFATC1 启动子、_613/NFATC1 607 和_5295/NFATC1 启动子上，并且Bmal1 跟这些启动子的结合与这些基因在不同时间点的RNA 变异是一致的。这意味着破骨细胞相关基因的振荡受生物钟基因Bmal1 的调节。染色质免疫沉淀显示Bmal1蛋白与CTSK和NFATc1启动子区域存在相互作用，Bmal1 的表达上调会增强CTSK 和NFATc1 的表达［20］。2016年美国骨与矿物质研究学会的一项数据表明，破骨细胞通过Bmal1 与SRC（类固醇受体共激活子）家族的相互作用以及与Nfatc1 启动子的结合来调节骨吸收［21］。研究者在破骨细胞中特异性地敲除Bmal1，敲除小鼠由于破骨细胞分化减少而显示出高骨量表型。

破骨细胞中Bmal1 被抑制可导致骨量减少。RANKL 是破骨细胞分化成熟的重要因子，RANKL信号通路对单核-巨噬细胞向破骨细胞的终末分化至关重要。成骨细胞和骨髓基质细胞表达的OPG 是抑制破骨细胞分化和活性的细胞因子。但最终决定破骨细胞分化和活性的是RANKL 与OPG的比值。在BMSCs 中，2 型糖尿病引起代谢和功能紊乱，导致骨稳态失衡，造成骨丢失。研究显示糖尿病BMSC 中Bmal1 被抑制，RANKL/OPG 比值升高，促进骨吸收。而Bmal1 过表达可增强BMSCs的成骨能力并抑制其破骨能力，从而改善了骨代谢［22］。

Bmal1缺乏可导致骨发育不全。RNA测序和蛋白质芯片分析表明，MMP3 是Bmal1 的潜在靶标，在昼夜节律紊乱或Bmal1 敲除小鼠中观察到下颌发育不全（SMH），在SMH 青少年患者中，MMP3 明显增加；在Bmal1 敲除小鼠3 ～10 周生长期间，MMP3 上调［23］。SMH 患者还存在Bmal1 和OPG 的表达下调，下颌骨骨量和骨体积减少，研究结果提示Bmal1 直接与Opg 启动子结合并上调其表达，从而抑制破骨细胞分化；体外外源补充OPG 显著逆转了由Bmal1 敲低引起的破骨细胞分化增强，通过腹膜内注射OPG 可部分逆转Bmal1 基因敲除引起的骨质流失［24］。

4 异常的骨代谢扰乱Bmal1 的表达

在骨关节炎发展过程中Bmal1 的表达逐渐降低，与正常软骨相比，OA 中Bmal1 的mRNA 和蛋白水平都显著下调。有研究［25］用IL-1β、过氧化氢或碱性磷酸钙晶体处理软骨细胞，结果与未处理的细胞相比，Bmal1 的峰值水平较低。N-甲基D-天冬氨酸受体亚单位（NMDAR）表达的改变会导致骨关节炎软骨细胞的昼夜节律和细胞表型改变。在骨关节炎软骨细胞中，NMDAR 抑制使PER2 和Bmal1 表达恢复到与正常软骨细胞相似的水平，并调控MMP13 和COL10A1 下调［26］。除此以外，在骨关节炎中，正常分化软骨细胞的表型丧失是导致疾病的原因之一。有研究调查了生物钟基因在正常软骨细胞与骨关节炎中表达是否有所不同，并使用RNAi 来确定观察到的差异是否会影响软骨细胞表型。研究［27］结果发现，骨关节炎软骨细胞中Bmal1 的表达明显较低。

TNF-α是RA 的关键靶标，RA 患者的血清及滑膜中TNF-α显著上调。TNF-α在体外和体内都会诱导多个生物钟基因的表达，并伴有昼夜节律波动。研究发现，在原代培养的RA 滑膜细胞中TNF-α可诱导Bmal1 过表达［28］。有研究对照分析RA 和OA患者滑膜中13 个生物钟基因的表达，发现在核心生物钟基因中，Bmal1的表达在一天中变化最大。

褪黑素对于骨重建过程有重要作用，可促进成骨细胞分化和骨成熟，并通过下调NF-κB 途径来抑制破骨细胞的分化。BMP-4是调控骨发育的关键信号分子。研究表明褪黑素、BMP-4 促使Bmal1表达显著上调，褪黑素对蛋白酶的抑制作用可以稳定SCN 中Bmal1 蛋白的表达，特别是在褪黑素水平正常升高的夜间。

5 总结与展望

Bmal1 基因多方面的参与骨代谢的生理、病理功能，但是相关机制复杂多变，有待进一步阐明。迄今为止，仍缺乏对不同类型的软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞等和单个生物钟基因的详细研究。了解软骨和骨骼中稳态和代谢的昼夜节律为治疗骨代谢疾病提供了一条新途径。在小鼠软骨中，大多数分解代谢基因的表达在清晨达到峰值，合成代谢基因的表达在深夜达到峰值［29］。因此，针对这些途径的药物应在其靶标最活跃的时刻使用，以在达到最大功效的同时将副作用降至最低。有研究用REV-ERB 激动剂SR9009 激活REVERB（Bmal1 转录的负调节剂）使Bmal1 表达下调，结果显示与OA 相关的痛觉过敏明显减少。通过敲除背根神经节（DRG）感觉神经元中的Bmal1 紊乱分子生物钟，可以减轻OA 模型的疼痛［30］。小分子调节剂可调节昼夜节律时间并恢复细胞稳态，其治疗潜力值得开发。另外，采用“时间疗法”的概念，可针对患者的昼夜节律量身定制药物或治疗方案，以最大程度地提高治疗效果并减少不良反应。今后将根据Bmal1 的分子机制研究出更多骨代谢相关疾病的干预措施。