UPLC-MS/MS 法测定糕点中安赛蜜的不确定度评定

莫礼艳，唐明华

（玉林市食品药品检验检测中心，广西 玉林 537000）

安赛蜜是一种人工合成甜味剂，化学名称为乙酰磺胺酸钾［1］，又称AK 糖，广泛应用于食品行业，若超量使用，则可能引起不同程度的中毒表现［2］，因此必须对其使用量进行严格管理。GB2760 食品安全国家标准《食品添加剂使用卫生标准》［3］对安赛蜜在糕点中的应用范围有明确的规定。因此对糕点中安赛蜜的监管不仅关系到产品的品质，更关系消费者的安全与健康［2］。在实际检测中，当安赛蜜的检出值在限量值附近时，实验室出具的检测结果直接关系到样品是否合格的判定［4］。因此，为确保结果的可信度，必须进行不确定度的评估。本研究对SN/T 3538—2013［5］糕点中安赛蜜的检测方法进行了不确定度评定，识别试验过程中不确定度的来源，量化各分量的不确定度，分析各分量的不确定度对检测结果的影响，以期优化检测过程，减少检测误差，保证检测结果的准确性［6］，为UPLC-MS/MS 法测定糕点中安赛蜜不确定度的评定提供参考依据［7］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色谱仪、Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱仪，美国Waters 公司；BSA822-CM 型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；ROATNTA 460R 型离心机，德国SIGMA 公司；541-10000-00-1 型涡旋混匀器，德国海道夫公司。

1.1.2 试剂 安赛蜜标准品，DR. 公司，批号为G129941，含量以99.18% 计，扩展不确定度U=0.56%；甲醇，默克股份两合公司，色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 标准工作溶液制备

1）标准贮备溶液（1 mg/mL）的制备。精密称取安赛蜜标准品约25 mg，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液溶解并定容至刻度，摇匀，4 ℃保存。

2）标准中间溶液（1 μg/mL）的制备。精密吸取安赛蜜标准品贮备液（约1 mg/mL）0.10 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，摇匀，4 ℃保存。

3）系列标准工作溶液的制备。分别精密吸取安赛蜜标准中间溶液（约1 μg/mL）0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，摇匀，即得。浓度分别为2、5、10、20、50、100 ng/mL。

1.2.2 供试品溶液的制备 称取2.00 g（精确至0.01 g）试样于50 mL 塑料管中，加入20 mL 甲醇∶水（1∶1）溶液，超 声提 取20 min，4 600 r/min 离 心5 min，上清液转移至50 mL 容量瓶中。重复提取1 次，合并上清液，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至50 mL。过0.45 μm 有机滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定［5］。

1.2.3 仪器条件

1）色谱条件。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相为0.1% 甲酸-5 mmol/L 甲酸铵溶液-乙腈（10∶90）；流速为0.25 mL/min；进样量为2 μL。

2）质谱条件。离子源为电喷雾离子（ESI）源，负离子模式；毛细管电压3.0 kV；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度300 ℃；RF 透镜电压0.5 V；脱溶剂气流速600 L/h；锥孔气流速50 L/h；采集模式为多反应离子监测（MRM）。监测离子参数见表1。

表1 安赛蜜离子对信息

1.2.4 不确定度分量的来源分析

2）不确定度分量。根据数学模型及测量过程，测定结果的不确定度分量主要来自标准贮备液的制备、系列标准工作溶液的配制、样品（前处理、回收率和测量重复性）和标准曲线拟合。

2 结果与分析

2.1 标准贮备液制备过程引入的不确定度urel（m）

2.1.1 由电子天平称量引入的不确定度u1，r（elm） 天平检定证书给出的示值允许误差±0.05 mg，服从均匀分布，k =，其标准不确定度为：u1(m) =

2.1.2 标准物质的纯度引入的不确定度u2，r（elm） 证书给出的标准不确定度U=0.56%，纯度为99.18%，相对标准不确定度为10-3。

2.1.3 标准贮备液定容引入的不确定度u3，rel（m） JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》［8］规定，25 mL A 级量瓶容量的允许误差为±0.03 mL，按三角形分布，由此产生的不确定度为10-2mL。试验环境温度为（20±5）℃，甲醇在20 ℃的体积膨胀系数为1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此产入 的 相 对 标 准 不 确 定 度 为 u3,rel(m) =

2.1.4 由标准贮备液制备过程引入的相对标准不确定度

2.2 系列标准工作溶液配制过程引入的相对不确定度urel（v）

系列标准工作溶液配制过程的不确定度主要由移液枪移取的体积、玻璃量器定容的体积、实验室的温度等引起。

2.2.1 标准工作溶液引入的不确定度u1，rel（v） 精密吸取安赛蜜标准品贮备液（1.0 mg/mL）0.10 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，配制后浓度约为1.0 μg/mL。 按照JJG 646—2006《移液器检定规程》［9］100 μL 移液器吸取100 μL溶液允许误差为±2.0%，按三角形分布，由此产生的不确定度为验环境温度为（20±5）℃，甲醇在20 ℃的体积膨胀系数为1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此产生的不确定度 为

吸液引入的相对标准不确定度为：u1-1,rel(v)=

JJG196—2006《常用玻璃量器检定规程》［8］规定，100 mL A 级量瓶容量的允许误差为±0.10 mL，按三角形分布，由此产生的不确定度为：u1-3(v) =

2.2.2 标准曲线溶液配制引入的不确定度u2，rel

（v） 标准曲线绘制时所使用移液器的量程有0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL。 按JJG 646—2006《移液器检定规程》［9］规定，容量允许误差分别为±4.0%、±3.0%、±2.0%、±1.5%、±0.6%、±0.6%，则由体积校准引入的相对标准不确定度分别为：

试验环境温度为（20±5）℃，甲醇在20 ℃的体积膨胀系数为1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此产生的不确定度为：

JJG196—2006《常用玻璃量器检定规程》［8］规定，10 mL A 级量瓶容量的允许误差为±0.020 mL，按三角形分布，由此产生的不确定度为：u2-3(v) =

试验环境温度为（20±5）℃，甲醇在20 ℃的体积膨胀系数为1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此产生

2.2.3 由标准系列工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel（v）为：

2.3 样品引入的相对不确定度u1，rel（r）

2.3.1 样品前处理引入的相对不确定度ure（lr） 50 mL A 级单标线吸量管容量允许误差为±0.05，按三角形分布，其标准不确定度为2.04 × 10-2。 试 验 环 境 温 度 为（20±5）℃，甲 醇 在20 ℃的体积膨胀系数为1.19×10-3/℃，按矩形分布，则由温度效应引入的标准不确定度为：u1-2(r) =0.172 mL。由以上2 项引入的合成样品定容引入的相 对 标 准 不 确 定 度 ： u1,rel(r) =

2.3.2 样品重复性引入的相对不确定度u2，rel（r）取阳性样品8 份进行测定，计算其平均值和标准偏差，平均值为0.940 9 mg/kg，标准偏差为1.9%。测量重复性标准不确定度为10-3。则测量重复性引入的相对标准不确定度为：重 复 性 结 果 见表2。

2.3.3 回收率引入的相对不确定度u3，rel（r） 试验设置高、中、低3 个浓度水平，各浓度水平分别准确称取空白样品2.0 g，分别精密加入“1.2.1”项下的标准品中间液0.4、1.0、2.0 mL ，按照供试品溶液的制备加标回收样品溶液，每个平行制备2 份，分别进样测定，计算加标回收率和相对标准偏差（RSD），平均回收率为96.42%，RSD 为1.2%。回收率标准不确定度为入的相对标准不确定度为5.08 × 10-3。加标回收结果见表3。

表2 重复性结果

表3 加标回收结果

2.3.4 样品引入的相对不确定度 综合以上3 个分量的不确定度，样品引入的相对不确定度为：

2.4 标准曲线拟合与测量重复性引入的相对不确定度urel（c）

安赛蜜的标准曲线方程与相关系数为：Y=262.631X-16.404 7，r=0.999 7，标准曲线结果见表4，平均值为32.018 ng/mL。根据《化学分析中不确定度的评估指南》［10］，由标准曲线拟合引入标准不确定度由下式计算：

SR=，式中，SR为标准曲线残差标准差；B 为斜率；C 为待测样品平均质量浓度；n 为标准曲线点数；p 为待测样品重复测定次数；C0为回归曲线各点质量浓度的平均值；C0j为回归曲线各点质量浓度；Yj为各标准溶液实际响应值；Y理论值为回归曲线所测理论值。

表4 标准曲线结果

3 扩展不确定度U

3.1 合成相对标准不确定度urel

3.2 相对扩展不确定度Urel

取 置 信 概 率P=95%，k=2，Urel= 0.206 × 2 =0.412。

3.3 扩展不确定度U

U = 0.940 9 × 0.412 = 0.39 (mg/kg)

4 讨论

通过分析和评估不确定度来源发现，对于结果不确定度影响为：系列标准工作溶液的配制＞标准曲线拟合＞标准储备液的制备＞样品（前处理、回收率和测量重复性），标准工作溶液的配制过程是不确定度的最主要来源［11］。因此，可以通过改进标准溶液配制，采用高精度的移液器和容量瓶，提升仪器设备的稳定性等措施来修正［12］。该试验根据CNASGL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》［10］分析UPLC-MS/MS 法测定糕点中安赛蜜的不确定度来源，建立科学的数学模型并量化各个影响分量，得出安赛蜜测定结果的扩展不确定度为0.39 mg/kg（k=2）。当测量结果接近限量值时，为检品判定提供依据，同时也为实验室日常质量控制提供参考［7］。