分子标记辅助选择培育抗稻瘟病和抗褐飞虱多基因聚合的水稻恢复系

李进波，杜雪树，夏明元，万丙良，戚华雄

（湖北省农业科学院粮食作物研究所/粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，武汉 430064）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上主要的粮食作物，但在生长期间会受到许多病虫害的为害，其中稻瘟病和褐飞虱是水稻的两大主要病虫害。目前，防治水稻稻瘟病和褐飞虱的主要途径是使用化学农药和种植抗性品种。但化学药剂的使用会对自然环境造成污染、增加成本、增大稻谷中的农药残留量等，而种植抗病虫品种既经济有效又对环境友好。因此，培育具有多种抗性的水稻品种对于防治水稻稻瘟病和褐飞虱具有重要意义。

20 世纪60 年代中期，日本率先开展了水稻抗稻瘟病基因的研究工作，鉴定了最初的8 个抗性位点上的14 个基因，并建立了一套抗稻瘟病基因的鉴别体系。随后，国际水稻研究所和中国等产稻国也逐渐开展了水稻稻瘟病抗性遗传的系统性研究。截至2015 年3 月，已至少报道了69 个抗稻瘟病位点共84 个主效基因，24 个抗稻瘟病基因被成功克隆［1］。其中Pi1 和Pi2 基因是2 个显性广谱抗稻瘟病基因，对中国各稻区菌株表现为广谱抗性，在抗稻瘟病抗性育种中具有重要的应用价值［2］。Pi1 被定位在第11 染色体长臂末端，与SSR 标记MGR4766 的遗传距离为1.3 cM，研究表明MGR4766 对Pi1 进行选择的准确率可达98%～100%［3］。Pi2 被定位在第6 染色体的短臂上，与SSR 标记AP22 的遗传距离为1.2 cM［4］，研究表明AP22 对Pi2 进行选择的准确率可达97%［5］。上述研究为利用分子标记辅助选择Pi1 和Pi2 基因培育抗稻瘟病水稻品种奠定了基础。

自20 世纪70 年代起，各国相继开展了水稻褐飞虱抗性基因的发掘工作，截至目前，从籼稻和野生稻中至少鉴定了27 个抗褐飞虱基因［6］，为培育抗褐飞虱水稻品种奠定了基础。Huang 等［7］从带有药用野生稻背景的渗入系B5 中鉴定了2 个显性抗褐飞虱基因Bph14 和Bph15，将它们分别定位在水稻第3 染 色 体 和 第4 染 色 体 上。 随 后，Yang 等［8］将Bph15 基因定位于47 kb 范围，并开发了一些与之紧密连锁的SSR 标记。在这些研究的基础上，利用分子标记辅助选择技术将抗褐飞虱基因Bph14 和Bph15 导入到杂交稻亲本中，已经成功地选育出抗褐飞虱的杂交稻亲本和杂交组合［9］。

R022 是湖北省农业科学院粮食作物研究所选育的携带抗褐飞虱基因Bph14 和Bph15 的恢复系，以其姊妹系鄂恢108 为父本配制的杂交组合巨风优108（巨风2A/鄂恢108）于2015 年通过湖北省农作物品种审定委员会审定，但区域试验抗性鉴定结果显示巨风优108 稻瘟病抗性综合指数为6.5，穗瘟损失率最高级9 级，高感稻瘟病。为了改良巨风优108 的稻瘟病抗性，本研究以R022 为轮回亲本、GD7 为供体亲本，通过分子标记辅助选择技术将抗稻瘟病基因Pi1、Pi2 与抗褐飞虱基因Bph14、Bph15聚合，培育同时具有稻瘟病抗性和褐飞虱抗性的水稻恢复系和杂交组合。

1 材料与方法

1.1 材料

轮回亲本R022 是湖北省农业科学院粮食作物研究所培育的抗褐飞虱恢复系，携带抗褐飞虱基因Bph14 和Bph15。供体亲本GD7 是广东省农业科学院水稻研究所培育的抗稻瘟病品种，携带抗稻瘟病基因Pi1 和Pi2。

1.2 分子标记和检测方法

利用分子标记MRG4766、AP22、76-2 和MS5分别检测Pi1、Pi2、Bph14 和Bph15 基因，分子标记的引物信息和PCR 反应程序见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR 反应体系总体积为15 μL，包括1.5 μL 10×buffer，1.2 μL dNTPs（各2.5 mmol），引物各0.3 μL（10 μmol），1 U Taq DNA 聚合酶，50 ng 模板DNA，最后用dd H2O 补足至15 μL。Taq DNA 聚合酶和其他相关试剂均购自Takara（Dalian，China）公司。PCR 反应在GenAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）中进行，扩增产物用0.6% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，结合银染显色检测。

1.3 杂交和选择程序

以R022 为母本、GD7 作父本杂交获得杂交种F1，再以R022 作轮回亲本连续回交3 次，然后自交4 次获得BC3F5株系。在回交过程中从BC1F1开始用分子标记检测抗稻瘟病基因Pi1 和Pi2，选择带有Pi1 和Pi2 基因且农艺性状偏向R022 的单株作父本。在BC3F2中选择农艺性状优良的株系逐株检测Pi1 和Pi2 基因，选择Pi1 和Pi2 基因纯合的单株再检测Bph14 和Bph15 基因。

1.4 杂交组合的配制

在BC3F4代选择遗传背景与R022 最接近的株系R650 作父本，与3 个不育系巨风2A、天丰A 和内香5A 分别配制杂交组合，同时轮回亲本R022 与不育系配制对应的杂交组合。

表1 目标基因的引物信息和PCR 反应程序

1.5 稻瘟病抗性鉴定

在湖北省恩施州农业科学院稻瘟病自然鉴定圃对R022、R650 及相应的杂交组合巨风2A/R650、天丰A/R650、内香5A/R650、巨风2A/R022、天丰A/R022、内香5A/ R022 进行稻瘟病鉴定。

1.6 褐飞虱抗性鉴定

褐飞虱抗性鉴定采用苗期集团鉴定法，将R022、R650 及相应的杂交组合巨风2A/R650、天丰A/R650、内 香5A/R650、巨 风2A/R022、天 丰A/R022、内香5A/ R022 及感虫对照品种Taichung Native1（TN1）催芽后的种子播在塑料盒中（60 cm×40 cm×10 cm），每处理1 行，播20 粒左右，行长20 cm，行距5 cm，正常水肥管理。待苗长至三叶一心时，每行取健壮一致的幼苗15 株用于接虫鉴定。按每株10 头2～3 龄若虫接虫，重复3 次。褐飞虱为稻田采集的混合群体，主要包含生物型Ⅱ，采集后在TN1 上饲养繁殖。当感虫对照品种TN1 死苗率达95% 左右时，调查其他鉴定材料的苗情，根据死苗率评定抗性级别。评价标准为：死苗率≤1.0%，级别为0，免疫；死苗率在1.1%～10.0%，级别为1，高抗；死苗率在10.1%～30.0%，级别为3，抗；死苗率在30.1%～50.0%，级别为5，中抗；死苗率在50.1%～70.0%，级别为7，中感；死苗率≥70.1%，级别为9，感。

1.7 农艺性状的考查

R650、R022 及相应的杂交组合巨风2A/R650、天丰A/R650、内香5A/R650、巨风2A/R022、天丰A/R022、内香5A/R022 种植在武汉市大田中，随机区组排列，3 次重复，每重复小区长6.7 m，宽2.0 m，每小区插10 行，每行40 穴，株行距16.7 cm×20.0 cm，成熟后每小区取样10 穴，分别考查株高、单株穗数、穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、千粒重、结实率等重要农艺性状，剩余材料全部收割测产。

2 结果与分析

2.1 分子标记辅助选择及目标基因纯合系的获得

利用与Pi1 和Pi2 基因紧密连锁的SSR 标记MRG4766 和AP22 对抗性基因供体亲本GD7 和受体亲本R022 进行多态性分析。MRG4766 在供体亲本中扩增产物片段较大，在R022 中扩增产物片段较小；AP22 在供体亲本中扩增产物片段较小，在R022 中扩增产物片段较大，MRG4766 和AP22 在供体亲本GD7 和受体亲本R022 之间都具有多态性（图1）。

图1 抗性基因Pi1 和Pi2 的连锁标记在BC1F1至BC3F1群体中的分离

分子标记辅助选择结合回交育种按以下程序进行：供体亲本与受体亲本R022 杂交，鉴定F1真假杂种后与R022 回交。在BC1F1群体中，经分子标记检测获得同时带有Pi1 和Pi2 基因的单株（图1），从中选择农艺性状与轮回亲本接近的单株作父本取混合花粉继续与R022 回交得到BC2F1。经分子标记检测获得带有Pi1 和Pi2 基因的单株，选择农艺性状与轮回亲本相似的单株作父本取混合花粉继续与R022 回交得到BC3F1。经分子标记检测获得带有Pi1 和Pi2 基因的单株套袋自交，分单株收种后种植成BC3F2株系，插秧一周后对每个单株定株编号取叶片备用。在分蘖期和抽穗期比较株系与轮回亲本R022 的性状差异，从中选择基本整齐一致、农艺性状优良且与R022 最相似的10 个株系。在收种前对这10 个株系所有单株的Pi1 和Pi2 基因进行检测，共获得Pi1 和Pi2 基因均纯合的单株48 个（图2）。然后用分子标记76-2 和MS5 分别检测这48 个单株的Bph14 和Bph15 基因，其中44 个单株的Bph14 和Bph15 基因均为纯合（图3），即获得Pi1、Pi2 和Bph14、Bph15 这4 个基因都纯合的单株44 个。最后从7 个株系中选择50 个单株种植成BC3F4株系，经田间表型观察这些株系的农艺性状已基本稳定，通过田间农艺性状的进一步比较，从BC3F4株系中选择36 个单株形成BC3F5株系。根据BC3F5株系田间农艺性状表现，综合性状优良的株系C650 入选，暂定名为R650。

图2 抗性基因Pi1 和Pi2 的连锁标记在BC3F2群体中的分离

图3 抗性基因Bph14 和Bph15 的连锁标记在BC3F2群体中的分离

2.2 稻瘟病抗性评价

在湖北省恩施州农业科学院稻瘟病自然鉴定圃对GD7、R022、R650 及相应的杂交组合进行稻瘟病鉴定，结果见表2。由表2 可知，R650 和供体亲本GD7 表现为抗，而受体亲本R022 表现为高感，R650的抗性明显强于R022 的抗性。杂交组合巨风2A/R650、天丰A/R650、内香5A/R650 的抗性综合指数在2.5～4.3，表现为中抗或中感；而巨风2A/R022、天丰A/R022、内香5A/R022 的抗性综合指数在5.3～6.8，表现为中感或感，R650 配制的杂交组合的稻瘟病抗性明显强于受体亲本R022 配制的相应杂交组合的抗性，说明利用分子标记辅助选择Pi1 和Pi2基因培育抗稻瘟病的恢复系和杂交组合是一种有效的途径。

2.3 褐飞虱抗性评价

采用苗期集团鉴定法鉴定R650、R022 及其杂交组合的褐飞虱抗性，鉴定结果表明R650 和R022抗性为3 级，表现为抗，R650 和R022 配制的杂交组合的抗性为5 级，均表现为中抗，而对照TN1 的抗性为9 级，表现为感，说明通过回交转育和分子标记辅助选择Bphl4 和Bph15 基因，育成品种的抗性能保持轮回亲本的抗性。R650 和R022 的抗性强于其杂交组合的抗性，说明Bphl4 和Bph15 基因在纯合状态下的抗性强于杂合状态下的抗性。

2.4 农艺性状考查

对R650、R022 及其杂交组合的主要农艺性状进行了考查，结果见表3。由表3 可知，R650 的基本农艺性状与R022 相似，杂交组合巨风2A/R650、天丰A/R650 和内香5A/R650 与对应的巨风2A/R022、天丰A/R022 和内香5A/R022 比较，在产量构成性状上没有明显的差异，小区产量基本在同一水平。这说明通过分子标记辅助选择选育的恢复系R650保持了轮回亲本R022 的优良性状，与不育系配制的杂交组合也保持了原有杂交组合的产量水平。

3 讨论

为了保留轮回亲本的优良性状，在回交过程中可以使用分子标记进行背景选择，通过选择背景回复率高的个体参加下一代的回交，能加快受体遗传背景恢复的速度。本研究在回交过程中没有利用分子标记进行背景选择，而是在每一次回交过程中选择农艺性状与轮回亲本相似的单株作父本，以加快轮回亲本遗传背景的回复率，同样能达到育种目标。

表2 稻瘟病抗性鉴定结果

表3 各材料农艺性状表现

培育的恢复系R650 与不育系巨风2A 配制的三系杂交中籼稻新组合巨风优650 参加了2015—2016 年湖北省中稻品种区域试验，2018 年完成了生产试验，2019 年8 月通过湖北省农作物品种审定委员会审定。区域试验抗性鉴定结果显示，巨风优650 稻瘟病抗性综合指数为2.4 级，穗瘟损失率最高级为3 级，中抗稻瘟病。进一步说明Pi1 和Pi2 基因在稻瘟病抗性育种中具有重要的应用价值。