乳酸菌富硒发酵研究进展

朱军燕，李焕梅，王砚妮，龙 同，高 娃，赵 筱，赵锦芳

（1.湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室，武汉 430068；2.湖北省农业科学院生物农药工程研究中心，武汉 430064）

硒是人体所必需的一种微量元素，具有抗肿瘤、抗氧化、增强人体免疫等生物学活性。缺硒可能导致心肌梗塞等疾病，与无机硒相比，有机硒吸收利用率高、营养价值好、使用安全、无毒副作用，是补硒的首选。近年来，通过微生物转化法生产有机硒研究取得了较快发展，富硒发酵工艺条件已趋成熟。目前在富硒微生物的研究中，酵母通常作为首选载体。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧，能利用葡萄糖产生50% 以上的乳酸，是能产生乳酸的一类细菌的总称。在自然界中种类繁多，分布广泛，目前已发现的乳酸菌有43 个属，包括373 个种和亚种［1］。作为益生菌中的一个类群，乳酸菌被广泛应用于食品、轻工、医药及饲料工业等许多行业。近年来，富硒乳酸菌因为其突出的抗氧化、抑菌、抗癌及抗突变等特性，受到学者的普遍关注。研究发现，作为一种元素富集型益生菌，许多乳酸菌能够吸附无机硒并将其生物转化成有机硒［2-4］。现已报道的具有富硒能力的乳酸菌主要集中于乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）和乳球菌属（Lactococcus）。本文对不同乳酸菌液体富硒发酵研究的现状进行综述，以期为富硒乳酸菌的选育和开发利用提供理论支撑。

1 乳杆菌属

已报道的具有富硒作用的乳杆菌很多，如鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）［5］、保加利亚乳杆菌（L. bulgaricus）［6］、布氏乳杆菌（L. buchneri）［7］、罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）［8，9］、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）［9］、干酪乳杆菌（L. casei）［10］、短乳杆菌（L. brevis）［11］、植物乳杆菌（L. plantarum）、副干酪乳杆菌（L. paracasei）、类布氏乳杆菌（L. parabuchneri）［12］等。

1995 年，Calomme 等［13］对3 株乳酸菌进行富硒培养时发现，当培养基中硒浓度为1 mg/L 时，德氏乳杆菌保加利亚亚种（L. delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC 11842）、植物乳杆菌（L. plantarum ATCC 14917）和干酪乳杆菌干酪亚种（L. casei subsp. casei ATCC e393）3 株菌的富硒量分别为253、375、407 μg/g 干菌体，这是乳杆菌对硒具有富集作用的首次报道。

汪波等［14］对嗜热链球菌（S. thermophilus）、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌3 株乳酸菌进行了耐硒能力比较，发现嗜酸乳杆菌耐硒能力最强，当含硒量为17 μg/mL 时，37 ℃下培养9 h，富硒率达到65.4%。

Saini 等［15］对25 株乳酸菌进行了耐硒、富硒能力试验，在MRS 培养基中添加10 μg/mL 亚硒酸钠，37℃发酵24 h 后，利用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP）测定总硒含量，其中2 株乳杆菌（L. reuteri NCDC77 和L. reuteri LB2 DSMZ）富硒量最高，分别为820.0、742.5 μg/g。

Mörschbächer 等［12］对尼泊金乳酸杆菌［L. parabuchneri（ML4）］、副干酪乳杆菌［L. paracasei（ML13、ML33、CH135 和CH139）］、植物乳杆菌［L. plantarum（CH131）］和 粪 肠 球 菌［Enterococcus faecalis（CH121 和CH124）］8 株乳酸菌富硒能力进行研究，在硒浓度为150 mg/L 时，L. paracasei ML13 和L. paracasei CH135 的富硒量最高，分别为38.1、40.7 mg/g。其他几种乳杆菌富硒发酵条件见表1。

表1 富硒乳杆菌发酵条件

2 链球菌属

2004 年，宋照军等［23］从酸奶中分离纯化出嗜热链球菌，通过浓度梯度法进行耐硒驯化后，采用番茄酵母培养基，接种量10%，培养温度39 ℃，pH 7，第6 天加硒，硒浓度为15 μg/mL，培养11 h，富硒率为72.8%。随后，孙林超［24］采用同样的方法获得嗜热链球菌，利用番茄酵母培养基，加硒时间为第5 天，硒浓度为16 μg/mL，接种量为10%，培养时间为10 h，培养温度为39 ℃，pH 为7，富硒率为71.6%。

此外，黄秀锦［25］用乳酸菌发酵剂（M）（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）水解脱脂乳培养基，最佳发酵条件为培养基初始pH 6.6，亚硒酸钠浓度为18 μg/mL，装液量为150 mL/250 mL 三角瓶，接种量5.5%，培养温度42 ℃，培养时间45.5 h。在此优化条件下，富硒乳酸菌生物量可达6.85 g/L，细胞硒含量达1 100 μg/g，硒总含量可达7 536 μg/L，细胞硒含量的92.15% 为有机硒。

张庆庆等［26］采用紫外-氯化锂诱变法对嗜热链球菌进行复合诱变，筛选得到1 株高富硒率的嗜热链球菌突变株ZZ-CW4，富硒率高达83.43%。

有研究者通过诱变、驯化等手段，筛选并获得硒多糖高产嗜热链球菌菌株，通过单因素试验、响应面法优化发酵条件，建立嗜热链球菌胞外含硒多糖的合成新工艺，并开发出高生物硒含量的混合菌株制剂［27-29］。

杨鹤［30］研究了5 种乳酸菌单菌和复合菌富硒能力及条件，在MRS 培养基中添加亚硒酸钠浓度为6 μg/mL，1% 接种量，37℃条件下培养，发酵至36 h时，嗜酸乳杆菌08001 与植物乳杆菌富硒转换率分别为66.37% 和55.81%，嗜热链球菌3.3 富硒转换率在60 h 最高，达66.09%。嗜热链球菌3.3 与保加利亚乳杆菌L5 的复合菌的富硒能力较好，在60 h时达到最大值70.44%，嗜热链球菌3.3 与保加利亚乳杆菌L9 在60 h 的富硒转换率为50.08%。通过研究证实，添加2% NaCl 可以使嗜酸乳杆菌08001的富硒能力提高到70.51%。

近几年，Yang 等［31］对乳酸菌富硒发酵进行了较为系统的研究，在不同条件下用德式乳杆菌亚种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行富硒培养，使用响应面方法优化Se 富集的初始pH、接种量和温度。结果表明，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最适初始pH、接种量和温度分别为5.96、6.73%、33 ℃和6.37、6.00%、40 ℃，保加利亚乳杆菌对硒的富集率达94.34%，嗜热链球菌则达97.05%。随后又研究了2 株乳酸菌L. delbrueckii ssp. Bulgaricus XN-L 和S. thermophilus XN-S 的抗菌活性，通过平板菌落计数法确定适合菌株生长的亚硒酸钠浓度为80 μg/mL，富硒乳酸菌XN-L 和XN-S 富硒量分别为12.05、11.56 μg/mL［32，33］。此外，通过对13 株乳酸菌的富硒能力和生物活性进行比较研究，发现植物乳杆菌L. plantarum WY3 耐硒质量浓度最高，为100 μg/mL，嗜热链球菌S. thermophilus WY12 的富硒率最高，为79.19%［34］。

2019 年，Castañeda-ovando 等［35］在最新的研究中发现，嗜热链球菌在丝氨酸存在的条件下可以将亚硒酸盐转化为硒代半胱氨酸。

3 肠球菌属

宋拓等［36］研究了富硒乳酸粪肠球菌（E. faecalis）微胶囊包埋工艺，获得产品率为82.68%，包埋后菌体存活率为72.15%，菌体硒含量为0.571 mg/g。包玉清等［37］对乳酸粪肠球菌最佳发酵产量和富硒量条件进行研究，硒添加量35 mg/L、接种量10%、发酵时间28 h、pH 4.5～6.3，经发酵获得的菌体产量为404.10 mg/100 mL，干物质产量683.14 mg/100 mL，菌体富硒量248.56 μg/100 mL，干物质富硒量393.21 μg/100 mL，发酵液环境硒量31.07 mg/L，干物质非有机硒量147.65 μg/100 mL。

2011 年，Pieniz 等［38］分离鉴定了36 株具有硒吸附能力的乳酸菌，其中E. faecalis LAB 14 和E.faecium LAB 18 对硒吸附能力最强，富硒量分别为475.9、459.9 μg/g。2013 年，该研究组又分离出1 株性状优良的耐久肠球菌E. durans LAB18s，发酵用脑心浸液肉汤培养基（BHI），初始添加240 mg/L 亚硒酸钠，在pH 为7.0，温度30℃发酵24 h，其富硒量最大可达176.97 mg/g 干菌体［39］。2017 年，他们又研究分析了E. durans LAB18s 生物量中有机硒的分布，发现总蛋白中有机硒含量最高，其次是多糖和核酸。采用不同提取方法得到的蛋白质组分中，碱溶性蛋白质的硒含量较高［40］。

2018 年，Mörschbächer 等［12］研究了包括粪肠球菌［Enterococcus faecalis（CH121 和CH124）］在内的8 株乳酸菌的富硒能力，发现在培养基中添加30 mg/L 或60 mg/L 亚 硒 酸 钠，E. faecalis CH121 和CH124 的富硒能力均很弱，仅为0.7 mg/g，菌体生物量也仅能达到23% 和17%。

2019 年，董晓芬等［41］筛选获得1 株富硒能力强且适宜发酵枳椇液的屎肠球菌E. faecium，在接种量为1%（v/v）、亚硒酸钠质量浓度为10 μg/mL、36 ℃培养24 h 条件下，富硒率达39.06%。

4 乳球菌属

齐睿婷等［42］对乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. Lactis LQ-12）富硒发酵工艺进行优化，采用BLX 培养基，当接种量8% 时，培养24 h，亚硒酸钠浓度为14 μg/mL，温度37 ℃，pH 6.6 时，乳酸乳球菌的有机硒转化率为59.87%。2015 年，Pusztahelyi等［43］筛选获得4 株高耐受硒的突变株Enterococcus faecium W54、Bifidobacterium animalis ssp. Lactis BB12、Lactobacillus casei 431 和Lactococcus lactis ssp.Lactis R703。在MRS 培养基中添加不同浓度NaHSeO3发酵后，各菌株富硒量均很高，E. faecium W54为54 362 mg/kg，L. casei 431 为37 428 mg/kg，R703为64 726 mg/kg，表现出很好的工业化应用潜力。

此外，李艳娇等［44］从泡菜中分离出活力强的乳酸菌，发酵有机米糠富集亚硒酸钠。最佳发酵条件为有机米糠添加量34 g、培养基装液量55 mL、接种量9%、种 龄8～16 h、发 酵 时 间48 h、发 酵 温 度37 ℃、亚硒酸钠添加量100 mg/L；经发酵乳酸菌的生物量可达9.94 g/L，有机硒的生产水平为7.46 mg/L。胡惠影等［45］对高富硒乳酸菌进行筛选研究，采用MRS 培养基，5% 接种量，培养温度37 ℃，适宜加硒时间为培养后8 h，培养时间为24 h，硒浓度为10 μg/mL 时，菌株JZ-07 富集转化硒能力最强，富硒量达19 413 μg/g 干菌体，转化率为89.00%。

5 小结

富硒益生菌产品具有广阔的应用前景，已成为研究热点。酵母是目前公认的有机硒富集最佳载体，而乳酸菌因其良好的风味和保健功能，已成为有机硒的一个新型来源。目前国内外对乳酸菌在抗氧化、抗菌及抗癌等领域的研究报道很多，关于其富硒发酵研究也日趋成熟，主要集中于富硒菌株的筛选（耐硒菌株的驯化、诱变）和培养条件优化（培养基、初始pH、温度、发酵时间、接种量、硒添加量、加硒方式等），以获得高富硒量和高生物量为目标。随着乳酸菌后基因组时代的到来，不同种属乳酸菌的硒代谢途径及控制机理还有待进一步深入研究，以期为富硒益生菌的开发提供参考和借鉴。